艾滋病是主要由HIV-1引起的危害人類健康的嚴(yán)重傳染性疾病。目前,高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)是治療艾滋病的最有效方法,然而,HIV-1耐藥突變株的出現(xiàn)影響了 HAART的功效。因此,迫切需要開發(fā)具有新機制、新結(jié)構(gòu)的靶向HIV-1復(fù)制關(guān)鍵環(huán)節(jié)的抗艾滋病藥物。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)在HIV-1復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RT通過兩種不同的酶功能將病毒單鏈RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA,即合成前病毒DNA的DNA聚合酶活性和選擇性降解DNA/RNA異源雙鏈中RNA鏈的RNase H活性。目前批準(zhǔn)上市的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑分為兩類:核苷(酸)類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(N(t)RTIs)和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs),它們均靶向于DNA聚合酶活性。尚無RNase H抑制劑上市,鑒于RNase H在病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用及其高度保守的活性位點,以RNase H為靶標(biāo)進行抗艾滋病創(chuàng)新藥物研究具有重要的科學(xué)意義與廣闊的前景。RNase H抑制劑可分為活性位點抑制劑和變構(gòu)抑制劑,前者研究更為廣泛�；钚晕稽c抑制劑通過螯合活性位點必需的兩個二價金屬離子發(fā)揮作用,其藥效團元素包括二價金屬離子螯合基團、疏水性基團及連接鏈(Linker)。目前該類抑制劑主要存在透膜活性弱、細胞活性差、毒性大等不足。因此,開發(fā)新型高效且具有細胞活性的HIV-1 RNase H抑制劑是需要迫切開展的研究工作。天然產(chǎn)物是抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)的重要源泉。多酚類化合物是具有抗氧化、抗腫瘤、抗心血管疾病及抗病毒等重要生理活性的天然產(chǎn)物。多酚結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基可通過螯合金屬依賴蛋白的螯合金屬離子,從而發(fā)揮廣泛的抑酶活性。1,3,4,5-Tetragalloylapiitol 是從植物Hylodendron gabuensis發(fā)現(xiàn)的一種多酚類HIV-1 RNase H選擇性抑制劑,IC50值為0.24 μM,且對人RNase H和大腸桿菌RNaseH抑制作用較弱,但未能表現(xiàn)出細胞水平的抗病毒活性。因此,本文選取1,3,4,5-tetragalloylapiitol為先導(dǎo),根據(jù)HIV-1RNaseH抑制劑的藥效團特征,運用結(jié)構(gòu)簡化及基于結(jié)構(gòu)的合理藥物修飾策略,提取關(guān)鍵藥效基團沒食子酰基為螯合骨架,以具有類藥性的取代哌啶和哌嗪基團作為疏水性基團及連接鏈(Linker),設(shè)計了含有哌啶(嗪)取代基團的多酚類化合物。并通過生物活性評價探討構(gòu)效關(guān)系,以期望提高活性,并改善化合物的理化性質(zhì)。本文首先采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法對目標(biāo)化合物進行了 HIV-1 RNase H抑制活性測試。結(jié)果顯示,其中大多數(shù)目標(biāo)化合物表現(xiàn)出顯著的RNaseH抑制活性。尤其是哌嗪系列,與哌啶系列相比,HIV-1 RNaseH抑制活性有了大幅度的提高(約10倍),且絕大多數(shù)化合物的HIV-1 RNaseH抑制活性均優(yōu)于陽性對照(β-thujaplicinol),其中14個化合物的IC50值達到亞微摩爾水平,化合物Ⅱ-25活性最高(IC50 = 0.72 ± 0.07 μM),約為β-thujaplicinol(IC50 = 1.98 ± 0.22 μM)的2.8倍。另外,本文還利用ELISA法對部分目標(biāo)化合物進行了 RT(聚合酶)抑制活性測試。在所測化合物中,僅有4個化合物對HIV-1 RT表現(xiàn)出較弱的抑制活性(100 μM),表明本文所設(shè)計的多酚類RNaseH抑制劑具有較高的選擇性。接著,在MT-4細胞系中測定了化合物抑制野生型HIV-1(ⅢB)、HIV-2(ROD)(MTT法)及野生型HIV-1/NL4-3(螢光素酶報告基因法)的活性與細胞毒性,遺憾的是,該類化合物在待測濃度下并未表現(xiàn)出明顯的抗病毒活性。值得一提的是,該類化合物細胞毒性較低(系列I:CC50 = 19.9-178.4 μM;Ⅱ-25:CC5050.8μM),優(yōu)于對照藥奈韋拉平(NVP)和齊多夫定(AZT)。為解釋該類化合物細胞活性喪失的原因,本文使用在線軟件(Molinspiration Cheminformatics Software)對抑酶活性最好的化合物Ⅰ-5和Ⅱ-25進行了理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果顯示,這兩個化合物存在極性過大的問題,LogP分別為0.04和-0.48,遠低于口服藥物的適宜LogP范圍(2-3)�？梢娫擃惢衔镙^差的透膜性可能由極性太強所致,進而在細胞活性試驗中未能表現(xiàn)出抗病毒作用。另外,本文采用Schrodinger套件的Glide模塊進行了分子模擬研究,結(jié)果顯示本文所設(shè)計的多酚類HIV-1 RNaseH抑制劑具有與β-thujaplicinol相似的作用模式,并能與His539、Lys540等氨基酸殘基產(chǎn)生額外的相互作用力,因此合理解釋了該類化合物活性提高的原因�？傊�,本文以 1,3,4,5-Tetragalloylapiitol 為先導(dǎo)化合物,根據(jù) HIV-1RNaseH抑制劑的藥效團特征,利用結(jié)構(gòu)簡化及基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計策略,先后設(shè)計合成了兩個系列(系列Ⅰ和Ⅱ)共計51個結(jié)構(gòu)新穎的多酚類HIV-1 RNase H抑制劑。生物學(xué)評價結(jié)果顯示,多種化合物具有較高的HIV-1 RNaseH抑制活性,明顯優(yōu)于β-thujaplicinol,可作為先導(dǎo)化合物供進一步研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

圖１．２?ＨＩＶ－１生物結(jié)構(gòu)示意圖［１２］??ＨＩＶ－１以人類免疫系統(tǒng)中的ＣＤ４＋Ｔ淋巴細胞為主要攻擊對象，其特有的結(jié)??構(gòu)為侵入細胞提供了必需的酶和蛋白。如圖１．３，?ＨＩＶ－１的生命周期可分為識別??與吸附、融合與穿入、逆轉(zhuǎn)錄與整合、轉(zhuǎn)錄與翻譯、裝配、出芽與成熟等過程［１３＿１５］。??識別與吸附、融合與穿入??ＨＩＶ－１侵入宿主體內(nèi)后，首先其表面的糖蛋白ｇｐｌ２０與免疫細胞表面的ＣＤ４??分子特異性結(jié)合完成吸附，然后ｇｐ４１在輔助性受體ＣＣＲ５和ＣＸＣＲ４協(xié)助下與??靶細胞膜接觸，引起ＨＩＶ－１表面糖蛋白變構(gòu)，外膜與細胞膜完成融合，使得ＨＩＶ－１??核心物質(zhì)釋放于宿主細胞內(nèi)。??逆轉(zhuǎn)錄與整合??ＨＩＶ－１進入宿主細胞后迅速將核衣殼脫去，釋放出病毒ＲＮＡ，在逆轉(zhuǎn)錄酶??作用下合成ＲＮＡ／ＤＮＡ雜合雙鏈，經(jīng)ＲＮａｓｅ?Ｈ作用降解掉ＲＮＡ鏈而得到病毒??８??

ＲＴ）、整合酶（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，ＩＮ?）、蛋白酶（Ｐｒｏｔｅａｓｅ，ＰＲ）和核心殼蛋白（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｉｓｄ，??ＮＣ）（圖?１．２）?［８－１１］。??圖１．２?ＨＩＶ－１生物結(jié)構(gòu)示意圖［１２］??ＨＩＶ－１以人類免疫系統(tǒng)中的ＣＤ４＋Ｔ淋巴細胞為主要攻擊對象，其特有的結(jié)??構(gòu)為侵入細胞提供了必需的酶和蛋白。如圖１．３，?ＨＩＶ－１的生命周期可分為識別??與吸附、融合與穿入、逆轉(zhuǎn)錄與整合、轉(zhuǎn)錄與翻譯、裝配、出芽與成熟等過程［１３＿１５］。??識別與吸附、融合與穿入??ＨＩＶ－１侵入宿主體內(nèi)后，首先其表面的糖蛋白ｇｐｌ２０與免疫細胞表面的ＣＤ４??分子特異性結(jié)合完成吸附，然后ｇｐ４１在輔助性受體ＣＣＲ５和ＣＸＣＲ４協(xié)助下與??靶細胞膜接觸，引起ＨＩＶ－１表面糖蛋白變構(gòu)，外膜與細胞膜完成融合，使得ＨＩＶ－１??核心物質(zhì)釋放于宿主細胞內(nèi)。??逆轉(zhuǎn)錄與整合??ＨＩＶ－１進入宿主細胞后迅速將核衣殼脫去，釋放出病毒ＲＮＡ，在逆轉(zhuǎn)錄酶??作用下合成ＲＮＡ／ＤＮＡ雜合雙鏈，經(jīng)ＲＮａｓｅ?Ｈ作用降解掉ＲＮＡ鏈而得到病毒??８??

亞基的Ｃ末端，與聚合酶活性位點相隔約１８個堿基對。ＲＮａｓｅＨ結(jié)構(gòu)域早已通??過Ｘ－射線及ＮＭＲ晶體學(xué)技術(shù)得到解析，包含五個＃折疊和四個《螺旋，其中??第１？４個《螺旋非對稱地分列于戶４的兩側(cè)，焊與其它＃折疊反向平行（圖１．５）??［３２＿３４］。ＲＮａｓｅＨ結(jié)構(gòu)的確證為準(zhǔn)確認(rèn)識其作用機制及相應(yīng)抑制劑的設(shè)計提供了依??據(jù)。??１２??
【參考文獻】

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本文編號：2843558