發(fā)布時(shí)間：2020-10-14 17:18

　　 背景:肝臟是膿毒癥主要累及的器官,膿毒癥患者的肝損傷發(fā)生率高達(dá)19%,通常死亡率高發(fā)且預(yù)后不良。研究表明,循環(huán)來(lái)源的單核細(xì)胞在內(nèi)毒素等刺激下浸潤(rùn)至肝臟,隨后分化為巨噬細(xì)胞,促進(jìn)炎癥介質(zhì)(如TNF-α,IL-1β和IL-6)和氧自由基(如NO)等的釋放,誘發(fā)肝功能障礙甚至肝衰竭。故單核/巨噬細(xì)胞分化結(jié)局與膿毒癥肝功能損傷密切相關(guān)。臨床上對(duì)應(yīng)對(duì)膿毒癥性肝損傷的手段有抗生素、抗炎、抗氧化和提高血液灌流等,但療效有限、預(yù)后較差,亟需開(kāi)發(fā)有效的治療策略和藥物。前期研究發(fā)現(xiàn),FC-99(N1-[(4-methoxy)methyl]-4-methyl-1,2-benzenediamine)是新型1,2-苯二胺類衍生物,具抗炎活性,可改善膿毒癥小鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)損傷,大大提高小鼠存活率。然而,FC-99緩解肝損傷的作用靶點(diǎn)和潛在機(jī)制尚未明確。許多研究表明,MicroRNAs是細(xì)胞生存/分化/凋亡等多種生物反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,能識(shí)別靶基因信使RNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū)域并與之結(jié)合,達(dá)到促進(jìn)其降解或阻止其翻譯的目的,最終抑制靶基因的產(chǎn)生。我們通過(guò)miRNAs表達(dá)譜芯片比較FC-99給藥前后對(duì)LPS刺激下的單核巨噬細(xì)胞差異表達(dá)miRNAs的影響,發(fā)現(xiàn)包括miR let-7a-5p在內(nèi)的9個(gè)miRNAs差異高表達(dá),又經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。提示,FC-99可能通過(guò)let-7a-5p發(fā)揮緩解肝損傷的作用。目的:旨在采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法誘導(dǎo)小鼠肝損傷,給予FC-99進(jìn)行干預(yù)處理,評(píng)價(jià)FC-99對(duì)膿毒癥小鼠的肝治療作用;分析其對(duì)外周血和肝組織中單核/巨噬細(xì)胞百分比的影響;采用干擾和過(guò)表達(dá)技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)外試驗(yàn),探索FC-99對(duì)單核/巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中l(wèi)et-7a-5p/Bcl-XL表達(dá)與凋亡的關(guān)聯(lián)及作用機(jī)制。方法:1.獲取48只雄性C57BL/6小鼠(8-10周齡)。CLP手術(shù)后12、24和72h行與假術(shù)組相同的操作,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共16只小鼠,每組8只,收集肝臟,RT-QCR法檢測(cè)let-7a-5p和Bcl-XL水平。2.首先,另取64只上述小鼠分為:假術(shù)組、CLP組、假術(shù)+ FC-99組和CLP + FC-99組,每組16只,隨機(jī)分配。CLP + FC-99組和假術(shù)+ FC-99組小鼠在術(shù)前2h進(jìn)行腹腔注射FC-99(10mg/kg),其余兩組小鼠則腹腔注射同等體積的DMSO。術(shù)后24h,收集每組各8只小鼠的血液和腹腔灌洗液,檢測(cè)細(xì)菌負(fù)荷量;分離血漿檢測(cè)TNF-α、IL-6、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平;收集肝臟制備組織切片,用HE法、TUNEL法觀察肝組織病理和肝細(xì)胞凋亡改變、RT-QCR法檢測(cè)肝臟中炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6等基因表達(dá)水平;收集血液和肝臟,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核/巨噬細(xì)胞百分比;術(shù)后7天,每組各取8只小鼠,觀察其生存情況并記錄存活率。然后,用佛波酯(PMA)和/或VD3誘導(dǎo)THP-1和HL-60單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。利用miRNAs表達(dá)譜芯片技術(shù)、TargetScan靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、AnnexinV/PI流式細(xì)胞術(shù)、RT-QPCR和螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析FC-99對(duì)let-7a-5p/Bcl-XL、Caspase3凋亡效應(yīng)蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)Graph Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因素方差t檢驗(yàn),p0.05表明不同組別間具有顯著差異。結(jié)果:1.與CLP組相比,FC-99提高CLP小鼠的生存率(p0.01),顯著減少術(shù)后24h腹腔以及血液中的細(xì)菌負(fù)荷水平(P0.001)、血漿TNF-α、IL-6、ALT和AST水平,顯著緩解肝臟病理結(jié)構(gòu)變化和肝細(xì)胞凋亡比例(P0.01),大幅降低肝內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α等的mRNA水平(P0.01),降低外周血促炎性Ly6Chi單核細(xì)胞和肝臟中F4/801o單核來(lái)源巨噬細(xì)胞比例(P0.01),誘導(dǎo)CD11b+細(xì)胞凋亡。提示:FC-99促進(jìn)肝內(nèi)單核細(xì)胞凋亡、減少F4/801o單核來(lái)源巨噬細(xì)胞緩解膿毒癥肝損傷。2.FC-99誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化中Annexin V+細(xì)胞、未活化caspase3蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01),巨噬細(xì)胞表面markerCD11b、CD14的陽(yáng)性率(P0.05)和mRNA水平均顯著降低(P0.01),Giemsa形態(tài)分析顯示單核樣細(xì)胞增多而巨噬樣細(xì)胞減少;VD3預(yù)處理過(guò)的HL-60單核細(xì)胞的CD11b和CD14陽(yáng)性率及基因表達(dá)均顯著升高(P0.05)。提示:FC-99可促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡,阻斷單核/巨噬細(xì)胞分化。3.與CLP組比較,FC-99治療組let-7a-5p表達(dá)顯著回升(P0.001),Bcl-XL表達(dá)水平則降低(P0.05);LPS處理的RAW264.7細(xì)胞中l(wèi)et-7a-5p的表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05),而B(niǎo)cl-XL在前6h的基因水平明顯增加(P0.05)。這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致;在PMA誘導(dǎo)分化的THP-1中轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物或抑制劑,其凋亡水平隨let-7a-5p水平高低而增減,Bcl-XL表達(dá)與let-7a-5p表達(dá)相反。提示:FC-99誘導(dǎo)let-7a-5p抑制Bcl-XL的產(chǎn)生。4.FC-99有效降低let-7a-5p inhibitor提高的CD11b+和CD14+細(xì)胞比例和CD11b、CD14基因水平,逆轉(zhuǎn)由于let-7a-5p下調(diào)導(dǎo)致的Bcl-XL表達(dá)升高以及巨噬細(xì)胞比例的增加。提示:FC-99靶向miRlet-7a負(fù)調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-XL,促進(jìn)單核細(xì)胞分化過(guò)程中的凋亡,抑制其分化。結(jié)論:FC-99通過(guò)上調(diào)let-7a-5p表達(dá)水平,減少抗凋亡蛋白Bcl-XL的產(chǎn)生,誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡,阻礙單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化,最終減少炎癥因子的產(chǎn)生。提示,FC-99可能是通過(guò)抑制單核/巨噬分化,達(dá)到緩解膿毒癥引起的肝臟炎性損傷的目的,FC-99對(duì)CLP誘導(dǎo)的小鼠肝功能損傷具有潛在的治療效果。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

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■?ｒ—１?＾?２〇°＇?■??ｓＪｎ＿＿ｎ?＼Ｕ＿ｐｎ??＾?＾?／?／?，沒(méi)?／?／??圖１－３?ＦＣ－９９降低ＣＬＰ小鼠血漿ＴＮＦ－ＣＸ和ＩＬ－６的蛋白水平??＊：與ｓｈａｍ組相比，ｐ＜０．０５；?＊＊：與ｓｈａｍ組相比，ｐ＜０．０１；?＃：與ＣＬＰ組相比，??ｐ＜０．０５；?＃＃：與?ＣＬＰ?組相比，ｐ＜０．０１??１．４．２?ＦＣ－９９改善膿毒癥小鼠肝損傷癥狀??（１）?ＦＣ－９９抑制肝損傷相關(guān)酶ＡＬＴ和ＡＳＴ的產(chǎn)生??為了確定ＦＣ－９９對(duì)膿毒癥小鼠肝損傷的作用，檢測(cè)了血漿中反映肝損傷的??指標(biāo)ＡＬＴ和ＡＳＴ的水平＠１。與假術(shù)組相比，模型小鼠的肝損傷相關(guān)酶的血漿含??量均顯著升高，均超過(guò)正常水平的３－４倍（Ｐ?＜０．０１）。而ＦＣ－９９治療后，與模型??組相比，ＡＬＴ和ＡＳＴ血漿水平均被顯著抑制了約５０％?（Ｐ＜０．０５），不到為正常水??平的２倍，表明ＦＣ－９９對(duì)肝損傷有卓越的保護(hù)作用。??２〇〇－｜?＊＊?５００?＂Ｉ?＊＊?＃??Ｉ?

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2840957