研究目的:肝細(xì)胞癌(HCC)有著居高不下的發(fā)病率與死亡率,已嚴(yán)重影響人類健康。人們正致力于開發(fā)新的肝癌治療手段或高效低毒的肝癌治療藥物。TDB是一個(gè)以苯并惡唑?yàn)槟阁w經(jīng)優(yōu)化合成得到的新型化合物,前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TDB對(duì)結(jié)腸癌、胃癌、肝癌和腎癌細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用。大量的研究表明,肝癌的發(fā)生和發(fā)展不僅與肝癌細(xì)胞分化異常、增殖過度有關(guān),還與細(xì)胞凋亡異常相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路在促使腫瘤細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡以及應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激方面起著關(guān)鍵作用,阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的過度激活可能是治療癌癥的新途徑。因此,本課題以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞及其裸小鼠移植瘤模型為研究對(duì)象,探討化合物TDB在體內(nèi)外的抗腫瘤作用及其可能的作用機(jī)制,為其開發(fā)成抗腫瘤新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1、采用MTT法檢測(cè)不同濃度TDB處理24 h、48 h、72 h后對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。2、采用倒置顯微鏡觀察TDB對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響。3、采用EdU法檢測(cè)TDB對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響。4、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TDB對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響。5、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TDB對(duì)SMMC-7721胞凋亡的影響。6、采用Hoechst 33258染色法檢測(cè)TDB對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響。7、采用Western blot法檢測(cè)TDB對(duì)細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。8、采用IVIS Kinetics小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)TDB對(duì)裸小鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用。9、采用HE染色法和免疫組化法檢測(cè)TDB對(duì)裸小鼠移植瘤組織細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度TDB作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后,能明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng),且呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)。2、倒置顯微鏡下觀察,空白對(duì)照組肝癌SMMC-7721細(xì)胞呈單層、梭形貼壁旺盛生長(zhǎng),細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密,形態(tài)規(guī)則,邊界清楚。TDB處理組肝癌SMMC-7721細(xì)胞,隨著濃度的增加,貼壁細(xì)胞量減少,細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞體積縮小,部分肝癌細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落漂浮于培養(yǎng)基現(xiàn)象。3、EdU法檢測(cè)結(jié)果顯示,不同濃度TDB作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖。TDB處理組DNA合成期的細(xì)胞比例明顯低于空白對(duì)照組。4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,TDB能抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)程,明顯阻滯細(xì)胞于S期。5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,TDB單用能促進(jìn)肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡,且凋亡率呈濃度依賴性上升。TDB聯(lián)用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002作用于肝癌SMMC-7721細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率明顯上升。6、Hoechst 33258染色法檢測(cè)結(jié)果顯示,TDB能誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡。7、Western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,TDB可上調(diào)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平,下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值,以上變化呈濃度依賴性趨勢(shì)。8、Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,TDB能下調(diào)p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)水平,抑制PI3K/Akt通路活性。9、裸小鼠肝癌原位移植瘤模型的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TDB具有抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)的作用。10、HE染色法和免疫組化法檢結(jié)果表明,TDB可誘導(dǎo)裸小鼠肝癌組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。結(jié)論:化合物TDB對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用,其作用機(jī)制可能與TDB抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化,通過線粒體通路下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá),激活下游促凋亡效應(yīng)型蛋白Caspases-3的表達(dá)有關(guān)。在動(dòng)物水平,TDB能夠抑制肝癌移植瘤的生長(zhǎng),具有體內(nèi)抗肝腫瘤活性。
【學(xué)位單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

圖 1.1 TDB 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1.1 The structure of TDB試生工生物工程（基 美國 美國 美國 H裂解液 碧云天生碧云天生 A (50X) 碧云天生劑盒 碧云天生美國 APBuffer 美國

.4 結(jié)果4.1 TDB 對(duì)肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響采用 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性，結(jié)果如圖 1.2 及表 1.1 所示，TDB 在實(shí)設(shè)濃度 5~20 μg/mL 范圍均能抑制肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)。除了 TD/mL 組在 24 h、48 h 時(shí)間點(diǎn) OD 值未見明顯變化外（P>0.05），TDB 5 μg 72 h 和 TDB 10、12、15、18、20 μg/mL 各濃度組 24 h、48 h、72 h 的 OD明顯下降，與空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或 P<0.01）。在同測(cè)時(shí)間內(nèi)，隨著濃度提高，TDB 對(duì)肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用隨強(qiáng)；其作用時(shí)間延長(zhǎng)，TDB 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的效果越明顯，呈明顯的濃度和依賴趨勢(shì)。經(jīng) Graphpad 7.0 軟件計(jì)算，TDB 對(duì)肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞不同時(shí)間 24、48、72 h 的 IC50值分別為 13.8 μg/mL、11.2 μg/mL、7.5 μg/mL。，選取 5、10、15 μg/mL 濃度 TDB 作用于肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞 48 h，作步研究。

0 1.1408±0.0493 1.0004±0.0689 0.8014±0.0768 - - -5 1.0171±0.0482 0.7362±0.0311 0.5266±0.0763**10.81 24.98 3410 0.8660±0.0608*0.5962±0.0897*0.3736±0.1143**24.13 39.32 5312 0.7470±0.0714*0.5450±0.0750*0.1890±0.0605**34.62 44.63 7615 0.5696±0.0391**0.3466±0.0790*0.1456±0.0347**50.09 64.92 8118 0.2091±0.0301**0.1910±0.0447*0.1080±0.0294**81.70 80.66 8620 0.1334±0.0206**0.1319±0.0089**0.0920±0.0215**88.33 86.58 88注：與空白對(duì)照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01。.4.2 TDB 對(duì)肝癌 SMMC-7721 細(xì)胞形態(tài)的影響采用倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖 1.3 所示，空白對(duì)照組肝MMC-7721 細(xì)胞形態(tài)正常，呈單層貼壁、旺盛生長(zhǎng)，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，邊界；而 TDB 處理組肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)不良，貼壁量減少，細(xì)胞間隙變大，形態(tài)變規(guī)則。隨著藥物濃度的升高，部分細(xì)胞甚至出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓、脫落漂培養(yǎng)基現(xiàn)象。
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本文編號(hào)：2835456