研究目的:肝細胞癌(HCC)有著居高不下的發(fā)病率與死亡率,已嚴重影響人類健康。人們正致力于開發(fā)新的肝癌治療手段或高效低毒的肝癌治療藥物。TDB是一個以苯并惡唑為母體經(jīng)優(yōu)化合成得到的新型化合物,前期實驗證實TDB對結腸癌、胃癌、肝癌和腎癌細胞的增殖均具有明顯的抑制作用。大量的研究表明,肝癌的發(fā)生和發(fā)展不僅與肝癌細胞分化異常、增殖過度有關,還與細胞凋亡異常相關。PI3K/Akt信號通路在促使腫瘤細胞分化、運動、轉移、抑制細胞凋亡以及應對各種應激方面起著關鍵作用,阻斷PI3K/Akt信號通路的過度激活可能是治療癌癥的新途徑。因此,本課題以人肝癌SMMC-7721細胞及其裸小鼠移植瘤模型為研究對象,探討化合物TDB在體內(nèi)外的抗腫瘤作用及其可能的作用機制,為其開發(fā)成抗腫瘤新藥提供實驗依據(jù)。實驗方法:1、采用MTT法檢測不同濃度TDB處理24 h、48 h、72 h后對SMMC-7721細胞生長的影響。2、采用倒置顯微鏡觀察TDB對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響。3、采用EdU法檢測TDB對SMMC-7721細胞增殖的影響。4、采用流式細胞術檢測TDB對SMMC-7721細胞周期的影響。5、采用流式細胞術檢測TDB對SMMC-7721胞凋亡的影響。6、采用Hoechst 33258染色法檢測TDB對SMMC-7721細胞凋亡的影響。7、采用Western blot法檢測TDB對細胞凋亡及PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響。8、采用IVIS Kinetics小動物活體成像系統(tǒng)檢測TDB對裸小鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用。9、采用HE染色法和免疫組化法檢測TDB對裸小鼠移植瘤組織細胞凋亡的影響。實驗結果:1、MTT法檢測結果顯示,不同濃度TDB作用于肝癌SMMC-7721細胞24、48、72 h后,能明顯抑制細胞生長,且呈現(xiàn)濃度和時間依賴效應。2、倒置顯微鏡下觀察,空白對照組肝癌SMMC-7721細胞呈單層、梭形貼壁旺盛生長,細胞間結構緊密,形態(tài)規(guī)則,邊界清楚。TDB處理組肝癌SMMC-7721細胞,隨著濃度的增加,貼壁細胞量減少,細胞間隙變大,細胞體積縮小,部分肝癌細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落漂浮于培養(yǎng)基現(xiàn)象。3、EdU法檢測結果顯示,不同濃度TDB作用于肝癌SMMC-7721細胞能明顯抑制肝癌細胞增殖。TDB處理組DNA合成期的細胞比例明顯低于空白對照組。4、流式細胞術檢測結果顯示,TDB能抑制肝癌SMMC-7721細胞進程,明顯阻滯細胞于S期。5、流式細胞術檢測結果顯示,TDB單用能促進肝癌SMMC-7721細胞發(fā)生凋亡,且凋亡率呈濃度依賴性上升。TDB聯(lián)用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002作用于肝癌SMMC-7721細胞后,細胞凋亡率明顯上升。6、Hoechst 33258染色法檢測結果顯示,TDB能誘導肝癌SMMC-7721細胞發(fā)生凋亡。7、Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達結果顯示,TDB可上調肝癌SMMC-7721細胞的Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達水平,下調Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值,以上變化呈濃度依賴性趨勢。8、Western blot法檢測PI3K/Akt通路相關蛋白表達結果顯示,TDB能下調p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)蛋白表達水平,抑制PI3K/Akt通路活性。9、裸小鼠肝癌原位移植瘤模型的體內(nèi)抗腫瘤實驗結果顯示,TDB具有抑制肝癌移植瘤生長的作用。10、HE染色法和免疫組化法檢結果表明,TDB可誘導裸小鼠肝癌組織發(fā)生細胞凋亡。結論:化合物TDB對肝癌SMMC-7721細胞具有抑制增殖和誘導凋亡作用,其作用機制可能與TDB抑制PI3K/Akt信號通路的活化,通過線粒體通路下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、上調促凋亡蛋白Bax的表達,激活下游促凋亡效應型蛋白Caspases-3的表達有關。在動物水平,TDB能夠抑制肝癌移植瘤的生長,具有體內(nèi)抗肝腫瘤活性。
【學位單位】：海南醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

圖 1.1 TDB 的化學結構Fig. 1.1 The structure of TDB試生工生物工程（基 美國 美國 美國 H裂解液 碧云天生碧云天生 A (50X) 碧云天生劑盒 碧云天生美國 APBuffer 美國

.4 結果4.1 TDB 對肝癌 SMMC-7721 細胞生長的影響采用 MTT 法檢測細胞生長活性，結果如圖 1.2 及表 1.1 所示，TDB 在實設濃度 5~20 μg/mL 范圍均能抑制肝癌 SMMC-7721 細胞生長。除了 TD/mL 組在 24 h、48 h 時間點 OD 值未見明顯變化外（P>0.05），TDB 5 μg 72 h 和 TDB 10、12、15、18、20 μg/mL 各濃度組 24 h、48 h、72 h 的 OD明顯下降，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學意義（P<0.05 或 P<0.01）。在同測時間內(nèi)，隨著濃度提高，TDB 對肝癌 SMMC-7721 細胞生長抑制作用隨強；其作用時間延長，TDB 抑制細胞生長的效果越明顯，呈明顯的濃度和依賴趨勢。經(jīng) Graphpad 7.0 軟件計算，TDB 對肝癌 SMMC-7721 細胞不同時間 24、48、72 h 的 IC50值分別為 13.8 μg/mL、11.2 μg/mL、7.5 μg/mL。，選取 5、10、15 μg/mL 濃度 TDB 作用于肝癌 SMMC-7721 細胞 48 h，作步研究。

0 1.1408±0.0493 1.0004±0.0689 0.8014±0.0768 - - -5 1.0171±0.0482 0.7362±0.0311 0.5266±0.0763**10.81 24.98 3410 0.8660±0.0608*0.5962±0.0897*0.3736±0.1143**24.13 39.32 5312 0.7470±0.0714*0.5450±0.0750*0.1890±0.0605**34.62 44.63 7615 0.5696±0.0391**0.3466±0.0790*0.1456±0.0347**50.09 64.92 8118 0.2091±0.0301**0.1910±0.0447*0.1080±0.0294**81.70 80.66 8620 0.1334±0.0206**0.1319±0.0089**0.0920±0.0215**88.33 86.58 88注：與空白對照組比較，*：P<0.05，**：P<0.01。.4.2 TDB 對肝癌 SMMC-7721 細胞形態(tài)的影響采用倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，結果如圖 1.3 所示，空白對照組肝MMC-7721 細胞形態(tài)正常，呈單層貼壁、旺盛生長，細胞間結構緊密，邊界；而 TDB 處理組肝癌細胞生長不良，貼壁量減少，細胞間隙變大，形態(tài)變規(guī)則。隨著藥物濃度的升高，部分細胞甚至出現(xiàn)細胞皺縮、變圓、脫落漂培養(yǎng)基現(xiàn)象。
【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 龍建武;張弋;刁藝;郭之通;;熒光裸小鼠源的人腦膠質母細胞瘤原位移植模型的建立[J];立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志;2016年05期

2 白俊英,張瑞君,劉英,俞發(fā)榮;裸小鼠在二級環(huán)境中的飼養(yǎng)試驗[J];中國獸醫(yī)科技;1999年07期

3 張素胤;;人癌裸小鼠模型系統(tǒng)在中國科學院上海藥物研究所建立[J];上海實驗動物科學;1996年01期

4 黃培根;裸小鼠移植瘤的轉移研究[J];癌癥;1990年04期

5 馮楚北;唐利軍;盧笑叢;雷德勇;周磊;;裸小鼠飼養(yǎng)繁殖與應用[J];上海實驗動物科學;1993年02期

6 楊斌;趙琳閣;;裸小鼠與人類腫瘤移植[J];腫瘤防治研究;1985年01期

7 黃強,杜子威;人癌移植于裸小鼠的實驗研究[J];江蘇醫(yī)藥;1987年09期

8 黃強;徐庚達;馬文雄;吳昀;陳桂林;談琪云;許期年;孫林泉;吳洪飛;周岱;奚為平;杜子威;;NC系裸小鼠的飼育與應用[J];上海實驗動物科學;1987年03期

9 王兆綽;肖旭光;馬麗;劉德明;;裸小鼠飼料滅菌方法的探討[J];上海實驗動物科學;1987年04期

10 黃培根;唐慰萍;沈淑靜;黃書偉;吳楓;莫梅英;蔡瓊珍;;九種體外培養(yǎng)細胞系裸小鼠移植的研究[J];湛江醫(yī)學院學報;1987年04期

相關博士學位論文 前10條

1 盛修貴;人子宮內(nèi)膜癌裸小鼠模型的建立生物學特性及其放射敏感性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1997年

2 楊建猛;益氣除痰方抗裸小鼠A549肺癌作用及對PERK-eIF2α信號通路影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2013年

3 陳艷;Gefitinib治療肺癌腦轉移藥代動力學基礎研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

4 刁藝;人腦瘤裸小鼠原位移植模型的親本性探索[D];蘇州大學;2008年

5 馬振桓;~(125)I粒子對胃癌移植瘤細胞增殖、凋亡和基因表達的影響[D];昆明醫(yī)科大學;2013年

6 楊曉春;新型抗腫瘤化合物MONCPT的藥效學及機制研究[D];浙江大學;2010年

7 陳哲;天然及靶向設計小分子化合物抗非小細胞肺癌活性和機制研究[D];浙江大學;2010年

8 唐文皓;人膽管癌裸小鼠移植瘤模型的建立及其應用[D];復旦大學;2003年

9 張萬福;碘-125（~(125)I）粒子組織間植入治療乳腺癌的實驗硏究[D];昆明醫(yī)科大學;2012年

10 王雪梅;COPS3基因對人肺癌細胞生物學活性的影響[D];吉林大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 林春華;化合物TDB對人肝癌SMMC-7721細胞及其裸小鼠移植瘤的抑制作用[D];海南醫(yī)學院;2019年

2 包閏;肝細胞癌Hepg2裸小鼠腹水模型的建立及其腹水微環(huán)境對Hepg2影響的研究[D];蘇州大學;2017年

3 吳自成;表達綠色熒光蛋白的裸小鼠培育與膠質瘤干細胞移植實驗研究[D];蘇州大學;2009年

4 芮琴;綠色裸小鼠中綠色熒光蛋白熒光示蹤作用研究[D];蘇州大學;2015年

5 周斌;胃腸道間質瘤細胞組織在不同周齡裸小鼠不同部位生長情況比較研究[D];鄭州大學;2010年

6 鄭達理;借助立體定位術和熒光界定GFP裸小鼠腦解剖結構[D];蘇州大學;2012年

7 牛文翠;不同照射模式、C225對CNE-2裸鼠移植瘤抑瘤及Bax、Bcl-2表達研究[D];新疆醫(yī)科大學;2011年

8 代興亮;綠色熒光蛋白Balb/c裸小鼠品系建立及在膠質瘤干細胞誘導宿主腫瘤間質細胞惡性轉化中的研究[D];蘇州大學;2014年

9 陳方志;羅格列酮誘導裸小鼠胃癌移植瘤細胞分化及其機制的研究[D];南華大學;2005年

10 彭曉兵;ADAM17-shRNA對裸小鼠MCF-7乳腺癌移植瘤的影響[D];華北理工大學;2015年

本文編號：2835456