背景及目的:化療藥物的臨床應(yīng)用常伴隨著一系列的不良反應(yīng),造成多器官、多系統(tǒng)損傷,嚴(yán)重影響患者的化療療效和預(yù)后。在泌尿系統(tǒng),化療藥物導(dǎo)致的損傷主要表現(xiàn)為急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)和出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis,HC),具有代表性的化療藥物分別是順鉑和環(huán)磷酰胺。目前臨床上針對AKI和HC的治療手段療效有限,以間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)應(yīng)用為代表的干細(xì)胞技術(shù)為其治療帶來了希望,然而MSCs在泌尿系統(tǒng)的應(yīng)用仍存在障礙。尿源干細(xì)胞(urine-derived stem cells,USCs)是相比于MSCs更適用于泌尿系疾病的種子細(xì)胞,USCs及USCs分泌的外泌體(exosomes secreted from urine-derived stem cells,USCs-Exo)在多種泌尿系疾病中具有治療作用,而在化療藥物導(dǎo)致的AKI、HC等泌尿系損傷中的應(yīng)用尚缺乏探索。本研究旨在探索USCs及USCs-Exo在化療藥物導(dǎo)致的泌尿系損傷中的應(yīng)用效果,并初步探討其機制,為臨床治療這類疾病提供新的思路與參考。方法:第一部分:探索USCs在順鉑誘導(dǎo)的大鼠AKI模型中的治療作用并初步探討其機制收集6名健康男性的無菌尿液用于USCs的提取及培養(yǎng)。CCK-8實驗檢測USCs的生長曲線;流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光檢測USCs的表面標(biāo)志物表達(dá);誘導(dǎo)分化實驗檢測USCs的多向分化能力;綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)慢病毒轉(zhuǎn)染USCs用于示蹤。取30只野生型雌性Sprague-Dawley大鼠隨機分為對照組、模型組及治療組,通過單次腹腔注射順鉑(5 mg/kg)的方式誘導(dǎo)大鼠AKI模型,模型建立后第1天通過尾靜脈注射應(yīng)用2×10~6 USCs作為治療。第2、4天各處死1只大鼠,共聚焦顯微鏡下檢測腎組織中GFP標(biāo)記的USCs,第4天處死所有大鼠,摘眼球取血,取腎組織。血生化檢測大鼠血清(serum creatinine,SCr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平;HE及PAS染色觀察大鼠腎組織學(xué)損傷變化,采用腎小管損傷評分、腎小球損傷計數(shù)、PAS陽性面積比評估大鼠腎組織學(xué)損傷程度;透射電鏡觀察大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的改變;Ki67免疫組化、TUNEL染色觀察大鼠腎組織增殖及凋亡的變化;Western Blot實驗檢測大鼠腎組織TNF-α、IL-6、NF-κB、BCL-2、BAX、cleaved caspase-3的表達(dá)變化。采用梯度濃度的順鉑誘導(dǎo)大鼠腎上皮NRK-52E細(xì)胞損傷,CCK-8實驗檢測順鉑的細(xì)胞毒性,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,選取合適的濃度誘導(dǎo)后續(xù)細(xì)胞損傷模型;細(xì)胞模型構(gòu)建后與USCs共培養(yǎng),CCK-8實驗檢測損傷細(xì)胞增殖活性的變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期及凋亡的變化。第二部分:探索USCs-Exo在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠膀胱炎模型中的治療作用并初步探討其機制用去除外泌體的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培養(yǎng)基培養(yǎng)USCs,2天后收集上清,超速離心法提取USCs-Exo,透射電鏡觀察外泌體形態(tài);粒徑分析檢測外泌體粒徑分布;Western Blot實驗檢測外泌體標(biāo)志蛋白。取45只野生型雌性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組及治療組,通過隔日注射1次,共4次的方式腹腔注射80 mg/kg的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠膀胱炎模型。模型建立后的第1天,通過尾靜脈注射含100μg總蛋白的USCs-Exo懸液作為治療,第4天處死所有小鼠取膀胱。HE染色觀察膀胱組織學(xué)損傷變化,軟件測量膀胱上皮厚度及黏膜下層的距離;甲苯胺藍(lán)染色觀察膀胱組織肥大細(xì)胞浸潤變化;Ki67免疫組化觀察膀胱黏膜增殖的變化;TUNEL染色觀察膀胱黏膜凋亡的變化;掃描電鏡觀察膀胱黏膜管腔面上皮超微結(jié)構(gòu)改變;Western Blot實驗檢測膀胱組織中TNF-α、IL-6、IL-10、NOX2、cleaved caspase-3的表達(dá)變化;尿動力學(xué)實驗檢測膀胱排尿功能變化。用100 ng/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)人膀胱上皮SV-HUC-1細(xì)胞的炎癥模型,用PKH67染色的USCs-Exo與SV-HUC-1共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡下觀察LPS誘導(dǎo)的SV-HUC-1對USCs-Exo的吸收;CCK-8實驗檢測SV-HUC-1細(xì)胞增殖活性的變化,劃痕實驗檢測SV-HUC-1細(xì)胞遷移能力的變化。提取USCs-Exo及相應(yīng)USCs中的RNA,small RNA測序探討可能的機制。結(jié)果:1.我們提取的USCs呈指數(shù)生長,可快速增殖;表達(dá)與MSCs類似的表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD105、CD133;不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31、CD34、CD45;表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA4;表達(dá)腎周細(xì)胞表面標(biāo)志物CD146、PDGFRB、NG2;能向平滑肌和上皮細(xì)胞分化。在USCs治療后,大鼠血清BUN、SCr水平顯著降低;腎小管損傷評分、腎小球損傷計數(shù)、PAS陽性面積比明顯降低;大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)明顯改善;腎小管上皮細(xì)胞增殖增加、凋亡減少;在第2、第4天均可在腎組織中發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的USCs;TNF-α、IL-6、NF-κB、BAX、cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯降低,BCL-2的表達(dá)水平明顯升高。梯度濃度的順鉑均可導(dǎo)致NRK-52E細(xì)胞增殖活性降低、細(xì)胞周期阻滯。選擇10μM、20μM誘導(dǎo)體外模型,與USCs共培養(yǎng)后,誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞增殖活性顯著升高、細(xì)胞周期阻滯改善,細(xì)胞凋亡率顯著下降。2.我們提取的USCs-Exo電鏡下呈典型的“杯盤狀”形態(tài);粒徑分布在80~200 nm;表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63。在USCs-Exo治療后,小鼠膀胱黏膜上皮厚度減少、黏膜下層距離明顯降低;肥大細(xì)胞浸潤明顯減少;黏膜上皮增殖率降低、凋亡率減少;膀胱上皮管腔面的超微結(jié)構(gòu)明顯改善;TNF-α、IL-6、cleaved caspase-3及NOX2的表達(dá)水平均下降、而IL-10的表達(dá)水平升高;小鼠排尿間隔延長、最大排尿壓下降。LPS誘導(dǎo)的SV-HUC-1細(xì)胞可吸收USCs-Exo,與USCs-Exo共培養(yǎng)后,增殖活性增強、遷移能力增強。small RNA測序提示USCs-Exo中的microRNA可能是其發(fā)揮治療作用的機制所在。結(jié)論:1.USCs可通過減輕炎癥反應(yīng),抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖,從而在體內(nèi)和體外減輕順鉑誘導(dǎo)的AKI大鼠模型的腎損傷;2.USCs對AKI大鼠模型的治療作用可能是通過USCs直接向腎組織歸巢分化或通過旁分泌方式發(fā)揮作用;3.USCs-Exo可通過減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激、抑制膀胱上皮細(xì)胞的病理性增生及凋亡、及促進(jìn)膀胱上皮細(xì)胞的遷移及分化,從而減輕環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠膀胱炎,促進(jìn)其排尿功能的恢復(fù);4.USCs-Exo對膀胱炎小鼠模型的治療作用很可能與其所含有的microRNA有關(guān)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

34圖 1. USCs 的生長特征。（A）USCs 初始種植第 3 天、第 7 天、P0 代、P3 代及誘導(dǎo)分化為平滑肌、上皮后的細(xì)胞形態(tài)，標(biāo)尺：50 μm，100 μm，200 μm；（B）USCs 的生長曲線；（C）流式細(xì)胞術(shù)檢測 USCs 的表面標(biāo)志物；（D）免疫熒光檢測 USCs 的表面標(biāo)志物，標(biāo)尺：25 μm。P0 代：原代；P3 代：第 3 代；SMC：smooth muscle cells，平滑肌細(xì)胞；UC：urothelial cells，上皮細(xì)胞；NC：negativcontrol，陰性對照。

圖 2. USCs 向平滑肌和上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。（A）向平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞平滑肌標(biāo)志物（Desmin、Myosin、ASMA、Vimentin）的表達(dá)明顯增加；（B）向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞上皮標(biāo)志物（UP-Ⅰa、UP-Ⅲ、AE1 /AE3、CK13）的表達(dá)明顯增加。標(biāo)尺：25 μm；SMC：smooth musclcells，平滑肌細(xì)胞；UC：urothelial cells，上皮細(xì)胞；NC：negative control，陰性對照。2.2.2 USCs 改善大鼠腎功能及組織學(xué)損傷為評價模型大鼠腎功能的恢復(fù)情況，測定各組大鼠血清 BUN 和 SCr 水平。相比于Normal 組，AKI+PBS 組的 BUN 和 SCr 均顯著升高（P＜0.001，P＜0.01），而在給予USCs 治療后，BUN 和 SCr 均下降（P＜0.001，P＜0.01）（圖 3C：a，b）。為了確定 USCs 對模型鼠組織學(xué)損傷的影響，采用 HE 和 PAS 染色分析大鼠腎的組織形態(tài)學(xué)改變。在腎髓質(zhì)中，與 Normal 組相比，可見 AKI+PBS 組出現(xiàn)大量腎小管壞死、管腔擴張、刷狀緣丟失、上皮細(xì)胞變扁平及管型；而相較于 AKI+PBS 組，AKI+USC組的腎小管損傷明顯減輕（圖 3A，B：medulla）。采用腎小管損傷評分，結(jié)果顯示 AKI+PBS

損傷數(shù)量；（e）PAS 陽性面積比。medulla：髓質(zhì)；cortex：皮質(zhì)； tubular injury score：腎小管損傷評分；number of injured glomeruli：腎小球損傷數(shù)量；PAS-positive area ratio：PAS 陽性面積比；**P＜0.01；***：P＜0.001。標(biāo)尺：髓質(zhì)：40 μm；皮質(zhì)：20 μm。2.2.3 USCs 改善大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)透射電鏡結(jié)果顯示各組大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)：模型鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)明顯損害，而經(jīng)USCs 治療后，腎臟超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善（圖 4）。在髓質(zhì)，Normal 組的腎臟超微結(jié)構(gòu)顯示近端小管上皮細(xì)胞完整，含有豐富的線粒體，細(xì)胞器無異常；AKI+PBS 組顯示腎小管上皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為：線粒體腫脹及嵴中斷、核固縮、自噬小體增多等；而AKI+USCs 組腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，只顯示輕微的線粒體水腫（圖 4 medulla）。在皮質(zhì)，Normal 組顯示完整的三層濾過屏障；相反的，AKI+PBS 組表現(xiàn)為內(nèi)皮水腫及空泡化、足細(xì)胞腫脹、系膜細(xì)胞增殖伴基質(zhì)擴張、節(jié)段性足突融合等，而 AKI+USCs 組僅表現(xiàn)為少量的系膜基質(zhì)擴張（圖 4 cortex）。

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4 方瑋s

本文編號：2832159