發(fā)布時間：2020-09-27 16:32

　　 局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis.FSGS)是兒童和成人腎病綜合征(nephroticsyndrome,NS)常見的腎小球疾病,是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一,而足細(xì)胞病變是FSGS的主要病理表現(xiàn)。足細(xì)胞是一種高度分化的腎臟實質(zhì)細(xì)胞,與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞以及基底膜共同構(gòu)成腎小球的濾過屏障,維持腎臟的濾過功能。因此尋找有效的治療和改善足細(xì)胞損傷的靶點具有非常重要的意義。近年來的研究表明,表觀遺傳修飾在局灶節(jié)段性腎小球硬化中起到重要作用。其中以乙�；癁榇淼慕M蛋白修飾受到越來越多的關(guān)注。組蛋白乙�；揎検怯山M蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)與組蛋白去乙�；�(histonedeacetylases,HDACs)共同調(diào)控。組蛋白去乙�；冈谌梭w中共發(fā)現(xiàn)18種,分為四個亞家族。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類是Zn2+依賴性的組蛋白去乙�；�,而Ⅲ類亞家族,也就是Sirtuin家族,其酶活性依賴于NAD+水平。SIRTs家族包括7個成員Sirt1-Sirt7。雖然已有研究表明Sirt1可以通過抗凋亡、抗炎癥等方式發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,但是SIRTs家族在局灶節(jié)段性腎小球硬化中的作用尚未報道。研究目的1.明確SIRTs家族各成員在局灶節(jié)段性腎小球硬化中的表達(dá)模式,并進(jìn)一步探討Sirt6是否參與局灶節(jié)段性腎小球硬化中的足細(xì)胞損傷。2.初步闡明Sirt6在局灶節(jié)段性腎小球硬化足細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及機(jī)制。研究方法和結(jié)果第一部分:Sirt6在局灶節(jié)段性腎小球硬化中的表達(dá)和作用1.Sirt6在局灶節(jié)段性腎小球硬化腎臟中的表達(dá)通過小鼠尾靜脈注射阿霉素(adriamycin,ADR)構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型,作為局灶節(jié)段性腎小球硬化動物模型。通過利用蛋白免疫印跡(western blot,WB)檢測Sirt1-Sirt7在阿霉素腎病小鼠腎臟皮質(zhì)中蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示在阿霉素腎病小鼠腎臟中Sirt1、Sirt5以及Sirt6的表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的下降。利用免疫熒光(immunofluorescence,IF)實驗檢測阿霉素腎病小鼠的足細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)變化。結(jié)果顯示Sirt6在阿霉素腎病腎臟足細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下降。2.在體外培養(yǎng)的各種腎臟實質(zhì)細(xì)胞中檢測ADR刺激下Sirt6的蛋白表達(dá)變化體外培養(yǎng)人源足細(xì)胞(human podocyte cell,HPC)、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cell,GENC)、系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC)以及腎小管上皮細(xì)胞(human renal proximal tubular cell,HK-2)分別給予ADR刺激24小時后,抽提細(xì)胞內(nèi)蛋白,進(jìn)行WB分析,檢測在ADR刺激下Sirt6在各種腎臟實質(zhì)細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示,足細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)水平顯著下降,內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)也出現(xiàn)不同程度的下降,系膜細(xì)胞中Sirt6的表達(dá)沒有明顯變化。3.足細(xì)胞特異性敲除Sirt6的小鼠的構(gòu)建利用Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建足細(xì)胞特異性敲除Sirt6(Cre+/Sirt6fl/fl 的小鼠,通過提取鼠尾DNA基因型鑒定確證敲除小鼠的構(gòu)建成功;另外,利用腎小球分離技術(shù)對敲除小鼠進(jìn)行腎小球分離,然后采用Real-time RT-PCR檢測腎小球內(nèi)Sirt6的mRNA水平,結(jié)果顯示在足細(xì)胞Sirt6特異性敲除小鼠的腎小球中Sirt6的mRN A水平明顯下降。4.足細(xì)胞敲除Sirt6加重阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞損傷C57BL/6J野生雄性小鼠與足細(xì)胞特異性敲除Sirt6(Cre+/Sirt6fl/fl 雄性小鼠隨機(jī)分為四組,構(gòu)建FSGS動物模型。檢測尿白蛋白/肌酐比值,并進(jìn)行PAS染色。結(jié)果顯示足細(xì)胞特異性敲除Sirt6加重阿霉素腎病的腎臟損傷。透射電鏡結(jié)果顯示敲除Sirt6加重阿霉素腎病小鼠足突的融合、脫落。IF標(biāo)記足細(xì)胞的裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin,結(jié)果顯示敲除足細(xì)胞Sirt6明顯下調(diào)阿霉素腎病足細(xì)胞中Nephrin和Podocin表達(dá)水平。5.Sirt6改善阿霉素腎病足細(xì)胞損傷通過腎臟注射Sirt6慢病毒表達(dá)載體,檢測腎小球Sirt6mRNA水平,從而確認(rèn)過表達(dá)Sirt6動物模型構(gòu)建成功。構(gòu)建阿霉素腎病模型后,檢測小鼠尿白蛋白/肌酐比值并進(jìn)行PAS染色。結(jié)果顯示過表達(dá)Sirt6減輕阿霉素腎病腎臟損傷。透射電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài),結(jié)果顯示過表達(dá)Sirt6減輕阿霉素腎病足突的融合、脫落,改善足細(xì)胞損傷。IF觀察不同處理組小鼠足細(xì)胞特異性蛋白Nephrin和Podocin蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明過表達(dá)Sirt6可上調(diào)阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞中Nephrin和Podocin的表達(dá)水平。體外實驗,WB檢測裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表達(dá)水平,結(jié)果顯示過表達(dá)Sirt6可逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的Nephrin和Podocin表達(dá)水平的下降。流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞凋亡,結(jié)果表明過表達(dá)Sirt6抑制阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。第二部分:Sirt6改善阿霉素腎病足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制1.檢測Sirt6對足細(xì)胞中Notch1和Notch4表達(dá)的影響通過IF雙染方法檢測敲除Sirt6后對阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞內(nèi)Notch1和Notch4的蛋白水平的影響。結(jié)果顯示,敲除Sirt6后,阿霉素腎病小鼠足細(xì)胞內(nèi)Notch1和Notch4表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Sirt6可明顯抑制ADR Cre+/irt6fl/fl小鼠足細(xì)胞中Notch1和Notch4的表達(dá)。2.檢測過表達(dá)Sirt6對Notch信號通路的影響WB結(jié)果顯示過表達(dá)Sirt6可抑制阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞Notch1和Notch4的蛋白表達(dá)。同時過表達(dá)Sirt6抑制Notch信號通路下游靶基因HES1和Snaill的蛋白表達(dá)。因此Sirt6通過負(fù)調(diào)控Notch信號通路從而改善FSGS足細(xì)胞損傷。結(jié)論及創(chuàng)新性1.本研究首次證實Sirt6在阿霉素誘導(dǎo)的FSGS小鼠模型中表達(dá)明顯下調(diào),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞特異性敲除Sirt6加重FSGS足細(xì)胞損傷,過表達(dá)Sirt6改善FSGS足細(xì)胞損傷。2.Sirt6可能通過負(fù)調(diào)控Notch信號通路改善FSGS足細(xì)胞損傷。本研究有助于進(jìn)一步闡明FSGS腎臟損傷的病理生理學(xué)機(jī)制,為設(shè)計和開發(fā)針對Sirt6的相關(guān)藥物并將其應(yīng)用于FSGS的防治中提供了重要的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

通過ＷＢ檢測阿霉素小鼠腎臟皮質(zhì)中ＳＩＲＴｓ家族各個亞型的表達(dá)，結(jié)果顯逡逑示，Ｓｉｒｔｌ、Ｓｉｒｔ５、Ｓｉｒｔ６的表達(dá)均有下調(diào)，但是以Ｓｉｒｔｌ和Ｓｉｒｔ６的下調(diào)最為顯著逡逑（圖１．１）�？紤]到我課題組己做過Ｓｉｒｔｌ在腎臟相關(guān)的研宄，所以本研宄主要逡逑集中探討Ｓｉｒｔ６在阿霉素誘導(dǎo)的ＦＳＧＳ足細(xì)胞損傷中的作用。逡逑Ｓｉｒｔｌ－＊邐＃＇ｆ邐１１６邋ｋＤａ逡逑ＧＡＰＤＨ－邋４Ｍ邐岕S

本文編號：2828108