大量的臨床研究結(jié)果表明,低密度脂蛋白-膽固醇(Low density lipoproteincholesterol,LDL-C)升高是促進心血管疾病CVD(Cardiovascular disease)發(fā)生發(fā)展的主要風(fēng)險因素。在目前的臨床實踐中,降低患者血脂水平,尤其是LDLC的水平是預(yù)防動脈粥樣硬化,減少心血管事件最為有效的治療方案。我國擁有著極其豐富的傳統(tǒng)中藥資源,并且擁有完整的中醫(yī)藥理論體系和數(shù)千年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗。以傳統(tǒng)中藥為源頭,結(jié)合現(xiàn)代藥理活性篩選,不僅有利于傳統(tǒng)藥物的藥理活性作用機制的闡明,更有利于天然活性化合物乃至先導(dǎo)化合物的高效、定向發(fā)現(xiàn)。本文從藥用植物的粗提物著手,利用人肝細胞系HepG2攝取DiI-LDL的體外活性篩選模型,篩選出細胞毒性弱且能夠促進細胞脂質(zhì)吞噬的藥物植物粗提物。接著,我們分離提取目標(biāo)粗提物中的小分子化合物,尋找可能發(fā)揮作用的小分子化合物。根據(jù)活性化合物的結(jié)構(gòu)類型和對細胞內(nèi)的LDLR和PCSK9蛋白水平表現(xiàn)出的不同調(diào)節(jié)作用,我們最終選取2個代表化合物進行了體內(nèi)外的藥效評價和作用機制研究,以期發(fā)現(xiàn)作用機制明確、降脂活性良好的小分子化合物,并比較不同結(jié)構(gòu)類型的化合物在降脂作用機制方面的異同。一.體外活性篩選我們利用人肝細胞系HepG2攝取DiI-LDL的體外活性篩選模型,檢測了67種藥用植物的粗提物促進細胞吞噬DiI-LDL的作用。其中,澤漆和王瓜根的粗提物表現(xiàn)出良好的促進細胞吞噬脂質(zhì)的作用,同時對于細胞的形態(tài)改變影響較弱。于是,我們分離提取并鑒定了澤漆和王瓜根粗提物中的小分子化合物,用同樣的體外篩選體系,檢測了120個小分子化合物促進細胞吞噬脂質(zhì)的作用。從中,我們發(fā)現(xiàn)了6個活性較好的化合物,并進一步檢測了6個化合物對于HepG2細胞中LDLR蛋白和PCSK9蛋白的含量的影響。根據(jù)這6個活性化合物的結(jié)構(gòu)類型,以及對HepG2細胞中LDL的受體LDLR(low-density lipoprotein receptor)和PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9)蛋白水平的影響不同,我們最終選取了升高LDLR蛋白水平和降低PCSK9蛋白水平的三萜化合物C4(23,24-二氫葫蘆素B,23,24-dihydrocucurbitacin B),和同時升高LDLR和PCSK9蛋白水平的二萜化合物A31(大戟苷L,euphornin L)作為代表性化合物進行后續(xù)的動物體內(nèi)藥效評價以及降脂作用機制的研究。二.化合物C4的作用機制研究C4具有抗炎、抗HIV-1(1型艾滋病病毒)等藥理活性,但其在脂質(zhì)代謝方面的調(diào)控作用還沒有被報道。本文首次在體外和體內(nèi)的水平上評價了化合物C4的降脂活性,并探索了化合物的降脂作用機制。我們發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中,化合物在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯后水平共同調(diào)控,升高胞內(nèi)LDLR蛋白的含量,增加細胞對LDL的吞噬作用。在轉(zhuǎn)錄水平上,C4升高成熟形式SREBP2蛋白的水平,增加LDLR mRNA的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄后水平上,C4穩(wěn)定LDLR mRNA,延長mRNA的半衰期。在翻譯后水平,C4降低細胞核內(nèi)HNF1α蛋白的水平,減少PCSK9蛋白的表達,降低PCSK9-介導(dǎo)的LDLR蛋白在溶酶體中的降解。在高脂飲食誘導(dǎo)的的高血脂金黃地鼠模型上,以灌胃給藥(Intragastric,i.g.)的方式給予C4(30 mg/kg/d)10天以后,給藥組金黃地鼠血清中的LDLC、總膽固醇(Total cholesterol,TC)和甘油三酯(Triglyceride,TG)的水平顯著降低。給藥三周以后,效果更顯著。同時,金黃地鼠肝臟組織中LDLR蛋白含量升高,而肝臟組織和血清中的PCSK9蛋白水平顯著降低。我們的研究表明,化合物C4具有對LDLR和PCSK9的雙重調(diào)節(jié)作用,為降脂藥物開發(fā),尤其是降低PCSK9蛋白表達的小分子調(diào)節(jié)劑的開發(fā),提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。三.化合物A31的降脂作用機制研究假白欖烷型二萜化合物的結(jié)構(gòu)和生物活性多樣,已報道的有抗炎和逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白(p-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)的活性等。目前針對假白欖烷型二萜化合物A31的生物活性研究主要集中在逆轉(zhuǎn)MDR的活性方面。本文首次在體外和體內(nèi)的水平上評價了化合物A31的降脂活性,并對其作用機制做了初步的探索。在HepG2細胞模型上,我們發(fā)現(xiàn)A31通過對LDLR轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的調(diào)控,增加胞內(nèi)LDLR蛋白的含量,促進細胞吞噬LDL。在轉(zhuǎn)錄后水平,A31增加LDLR mRNA的穩(wěn)定性,延長LDLR mRNA的半衰期。在翻譯后水平,化合物影響PCSK9蛋白的分泌過程,導(dǎo)致胞內(nèi)PCSK9蛋白含量升高,而分泌到胞外的PCSK9蛋白減少,進而降低PCSK9-介導(dǎo)的LDLR蛋白在溶酶體中的降解。在高血脂金黃地鼠動物模型上,給藥三周后(i.g.,30 mg/kg/d),A31顯著降低金黃地鼠血清中的TC和LDL-C水平。同時,金黃地鼠肝臟組織中的LDLR和PCSK9蛋白含量升高,而血清中PCSK9蛋白含量顯著降低。我們的研究表明,與化合物C4相似,化合物A31同樣可以通過對LDLR和PCSK9的雙重調(diào)控作用增加胞內(nèi)LDLR蛋白的水平。不同的是,C4還通過轉(zhuǎn)錄水平影響LDLR mRNA的轉(zhuǎn)錄。此外,兩個化合物對PCSK9蛋白的調(diào)控方式不同。C4通過影響PCSK9 mRNA的轉(zhuǎn)錄,減少PCSK9的蛋白表達;而A31對PCSK9的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達沒有顯著影響,主要通過減少PCSK9蛋白的分泌,增加胞內(nèi)LDLR蛋白的含量。綜上,本文利用DiI-LDL吞噬活性體外篩選模型,從藥用植物的粗提物著手,篩選具有促進細胞吞噬LDL的目標(biāo)粗提物。然后從目標(biāo)粗提物中提取分離小分子化合物,建立小分子化合物庫。接著利用同樣的體外篩選模型,篩選出具有促進細胞吞噬LDL的活性小分子化合物。最終選取兩個化合物作為兩種結(jié)構(gòu)類型的代表,進一步在體內(nèi)評價了兩種化合物的藥效活性,并深入研究了兩個化合物的降脂作用機制,展示了兩種不同的LDLR和PCSK9的雙重調(diào)控策略。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海藥物研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R914
【部分圖文】：

圖 1.1 PCSK9 蛋白的突變位點[31]Figure 1.1 The mutations in PCSK9 protein2.3.2 PCSK9 的功能循環(huán)中的 LDL 主要由各組織細胞中細胞表面的 LDL 受體（LDLR, LDLreceptor）攝取并內(nèi)吞進入細胞進行代謝[34]。其中肝臟是其主要的代謝場所，大約 80%的 LDL 由肝臟清除[34]。LDLR 通過配體結(jié)合區(qū)域識別并結(jié)合 LDL 中的ApoB，形成 LDLR-LDL 復(fù)合體。LDLR-LDL 復(fù)合體在內(nèi)吞接頭蛋白 ARH（autosomal recessive hypercholesterolemia）等組成的網(wǎng)格蛋白（clathrin）復(fù)合體的介導(dǎo)下內(nèi)吞進入細胞內(nèi)。隨著網(wǎng)格蛋白復(fù)合體迅的解體，網(wǎng)格蛋白包裹下的內(nèi)吞小泡相互融合，形成內(nèi)吞體（endosome）[35]。隨著內(nèi)吞體中 pH 的降低，LDL 與 LDLR 解離，LDL 在溶酶體中被降解，LDLR 則回到細胞膜表面進

圖 1.2 PCSK9 的功能[44]Figure 1.2 The function of PCSK9 protein2.3.3 PCSK9 單克隆抗體2015 年，PCSK9 的兩個人源化的單抗，Alirocumab（Regeneron 公司與Sanofi 公司） 和 Evolocumab（Amgen 公司），被 FDA（Food and DrugAdministration）先后批準(zhǔn)。臨床 II 期和 III 期研究結(jié)果表明，兩個單抗可降低約 60%的 LDL-C 水平，降低約 50%的心血管事件[43, 45]。且與他汀單獨用藥相比，單抗與他汀的聯(lián)用可進 步降低動脈粥樣硬化性心血管疾�。╝therosclerotic cardiovascular disease, ASCVD ）的風(fēng)險，顯著地降低心血管事件的死亡率[42, 43, 46]。1) 他汀聯(lián)合 PCSK9 單抗

降脂小分子化合物的篩選與作用機制研究此外，指南中除了推薦雜合性高膽固醇血癥患者使用 PCSK9 單抗作為 級預(yù)防（primary prevention）以外，其他 ASCVD 患者應(yīng)首要考慮使用依折麥布與他汀聯(lián)合用藥，其次考慮 PCSK9 單抗與他汀聯(lián)合用藥（詳見圖 1.3）[52]。在我國，新的家族性高膽固醇血癥的治療方案（2018 年）也遵循這 原則[53]。（詳見圖 1.4）

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉娉娉;;體育營銷提升企業(yè)品牌資產(chǎn)作用機制及策略研究[J];文化創(chuàng)新比較研究;2017年19期

2 殷建新;;昆蟲中抗菌肽的研究進展[J];課程教育研究;2017年34期

3 段婧;黃衛(wèi)東;;鞣花酸抗癌作用機制研究進展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2017年01期

4 T3生一;;戄刺治療曁尾炎失效病例分析及其作用機制的初步探

本文編號：2825375