阿霉素(doxorubicin,DOX)是一種療效確切且價格低廉的廣譜抗腫瘤藥物,但嚴重的毒副作用而且腫瘤細胞對其易產(chǎn)生耐藥,限制了DOX臨床應(yīng)用。因此建立腫瘤靶向、可逆轉(zhuǎn)耐藥、并能在腫瘤細胞內(nèi)有效釋放DOX的遞藥系統(tǒng)是目前研究的熱點。葉酸受體(folate receptor,FR)在多種腫瘤細胞表面高表達,經(jīng)葉酸修飾的遞藥系統(tǒng)具有腫瘤主動靶向功能。當腫瘤細胞對DOX產(chǎn)生耐藥時,DOX被快速泵出腫瘤細胞,不能到達細胞核發(fā)揮作用。研究表明,線粒體也是DOX的作用靶點,如果能將DOX定向遞送至線粒體,可有效逆轉(zhuǎn)耐藥,提高DOX的抗腫瘤作用。大分子遞藥系統(tǒng)進入腫瘤細胞后首先分布于內(nèi)涵體/溶酶體等酸性細胞器中,具有酸敏特性的遞藥載體可實現(xiàn)藥物的胞內(nèi)定位突釋。目的:本研究利用脂性陽離子(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)對線粒體具有高親和力的特性,制備具有線粒體靶向功能的連接物TPP-DOX,并將DOX和TPP-DOX同時包封于葉酸(folic acid,FA)修飾的酸敏聚合物膠束中,以期得到高效、低毒、控釋、有效逆轉(zhuǎn)耐藥的DOX聚合物膠束,提高DOX的抗腫瘤作用。方法:以DOX和TPP為原料合成TPP-DOX。以棕櫚酸(palmitic acid,PA)、聚天門冬氨酸(polyaspartic acid,Pasp)、葉酸(FA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等為原料,采用腙鍵將親水材料和親脂材料連接,合成酸敏聚合物材料PA-hyd-PEG-FA和Pasp-hyd-PEG-FA。通過核磁、質(zhì)譜、紅外等方法鑒定化合物結(jié)構(gòu)。分別采用乳化-溶劑揮發(fā)法和透析法制備同時包封DOX和TPP-DOX的酸敏膠束DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA,并對膠束進行表征。將載藥膠束分散于不同p H值的磷酸鹽緩沖溶液中,觀察膠束的體外釋藥特性。采用MTT法研究載藥膠束的體外抗腫瘤活性。采用試劑盒法考察載藥膠束對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細胞對膠束的攝取,以及DOX在腫瘤細胞亞細胞室的分布情況。建立荷瘤裸鼠模型,考察載藥膠束的體內(nèi)抗腫瘤活性,并采用活體成像儀觀察DOX在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布。結(jié)果:1.波譜學鑒定結(jié)果顯示合成產(chǎn)物波譜學特性符合目標產(chǎn)物特征。2.DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA粒徑為237 nm,DOX和TPP-DOX的載藥量分別為8.6%和10.3%,在p H7.4條件下放置4天,膠束粒徑未發(fā)生明顯變化。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA在p H值7.4、6.5以及5.0的磷酸鹽緩沖溶液中孵育72 h后,DOX的累積釋放百分率分別為52%、67%以及86%,TPP-DOX的累積釋放百分率分別為51%、65%以及95%,呈現(xiàn)出明顯的p H依賴性。MTT實驗證實,空白膠束無明顯細胞毒性。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA通過葉酸受體介導進入細胞,與游離DOX相比,其細胞毒性顯著增加,對耐DOX腫瘤細胞MCF-7/ADR仍表現(xiàn)出較強的細胞毒性。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示,DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可顯著增加腫瘤細胞Caspase 3含量。熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明,載藥膠束可將DOX高效遞送至腫瘤細胞內(nèi),并實現(xiàn)DOX的線粒體和細胞核定位分布。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可提高DOX在腫瘤組織的分布,劑量依賴性地抑制荷瘤(MCF-7/ADR細胞)裸鼠腫瘤生長,其體內(nèi)抗腫瘤活性明顯優(yōu)于游離DOX,并且降低了DOX的毒副作用。3.DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)的粒徑為193 nm,DOX的載藥量為7.9%,TPP-DOX的載藥量為12.4%。在p H7.4條件下放置30天,膠束的粒徑未發(fā)生明顯改變。MTT實驗證實,空白膠束無明顯細胞毒性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)體外釋藥具有明顯的p H依賴性,對葉酸受體高表達的KB細胞及耐DOX的MCF-7/ADR細胞均顯示出較強的細胞毒性,且呈現(xiàn)顯著的誘導凋亡活性。熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可將DOX轉(zhuǎn)運至細胞核和線粒體。靜脈注射給予DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)后,DOX主要分布于荷瘤(KB細胞)裸鼠腫瘤組織,表現(xiàn)出良好的腫瘤靶向特性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可劑量依賴性的抑制荷瘤裸鼠腫瘤的生長,其體內(nèi)抗腫瘤活性明顯強于游離DOX,降低了DOX的心臟毒性。結(jié)論:DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)體外釋藥具有酸敏特性,可將DOX遞送至腫瘤細胞線粒體和細胞核,增強了DOX的抗腫瘤活性,可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,減少了DOX在正常組織的分布,降低了DOX的毒副作用。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

圖 1 TPP-DOX 的合成路線圖示意圖。2.2 棕櫚酸-聚乙二醇-葉酸（PA-hyd-PEG-FA）的合成PA-hyd-PEG-FA 的合成路線如圖 2 所示，稱取 1g（3.91 mmol）PA、0.9g（7.83mmol） NHS、1.5g（7.85 mmol） EDCI 溶于 20mL 二氯甲烷中，室溫攪拌 5 h。加入 0.9 g（6.87 mmol） Boc-NH-NH2和 30μL 三乙胺，室溫反應(yīng) 24 h，反應(yīng)產(chǎn)物PA-NH-NH2-Boc 通過硅膠柱層析純化（石油醚:乙酸乙酯=1:2）。1g（2.58 mmol）PA-NH-NH2-Boc 加入 5 mL 二氯甲烷中，再加入 2 mL 三氟乙酸，加熱回流 2 h，再加入 10 mL 水，用二氯甲烷萃取，有機相通過無水 Na2SO4干燥，真空旋轉(zhuǎn)蒸干得到產(chǎn)物 PA-NH-NH2。稱取 1g（2.27 mmol） FA、0.5g（4.38 mmol） NHS、0.9g（4.71 mmol） EDCI溶于 20mL 二甲亞砜（DMSO）中，室溫反應(yīng) 12 h，逐滴加入溶有 4g（1 mmol） PEG的 10mL DMSO 溶液，攪拌，反應(yīng) 4 h，加入 50 mL 水稀釋，過濾得濾液，將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，對水進行透析（截流分子量 1000 Da），凍干，得 FA-PEG-NH2。

-28-圖 2 PA-hyd-PEG-FA 的合成路線示意圖。2.3 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 的制備采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備載藥膠束。將 10 mg FA-PEG-hyd-PA 溶于 20 mL 二氯甲烷中，在劇烈攪拌下滴加溶有 2 mg DOX 和 2 mg TPP-DOX 的 3%PVA 水溶液，繼續(xù)攪拌使有機溶劑揮發(fā)，4 °C 離心（15000 rpm, 15 min），沉淀用蒸餾水洗滌三次，純水分散得膠束 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 溶液，凍干得固體。2.4 膠束的特性表征2.4.1 DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA 的粒徑及形態(tài)稱取膠束 5 mg，溶于 5 mL 雙蒸水中，用 Zeta 電位及納米粒度分析儀測定膠束的粒徑分布。取一滴滴于載網(wǎng)上，溶劑揮發(fā)干后，磷鎢酸染色，透射電鏡下觀察。

TPP-DOX的質(zhì)譜圖

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本文編號：2825374