難溶性化合物的制劑學(xué)研究是新藥研發(fā)的重大難題。據(jù)統(tǒng)計,藥物發(fā)現(xiàn)階段有高達(dá)70～80%的活性成分均存在水溶性差的問題,如何利用制劑學(xué)的手段來提高這些活性分子的生物利用度對藥劑工作者來說是一個巨大的挑戰(zhàn)。納米晶技術(shù)是近年來興起并逐步應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的新興技術(shù),它是僅由藥物晶體與少量穩(wěn)定劑形成的亞微米膠體分散體系,可以顯著改善難溶性藥物的溶解度和溶出速度。由于只含有少量穩(wěn)定劑,納米晶的理論載藥量可高達(dá)100%,且與納米載體藥物相比,納米晶在藥物輸送能力和穩(wěn)定性方面更優(yōu)越,毒副作用更低。此外,納米晶劑型豐富,涵蓋口服、經(jīng)皮、注射等多種途徑給藥,為藥物的臨床應(yīng)用提供了更多選擇。截止到目前,有17個納米晶制劑品種已批準(zhǔn)上市,超過20種產(chǎn)品正在進(jìn)行臨床試驗。在過去的二十年中,納米晶被認(rèn)為是最成功的納米技術(shù)藥物之一。目前有關(guān)納米晶的研究主要集中在制備與表征,機(jī)制研究較少。大多數(shù)納米晶制劑的制備和優(yōu)化是基于操作的可行性,僅僅是處方組成及工藝參數(shù)范圍的考察,缺乏體內(nèi)機(jī)制研究,難以支持與指導(dǎo)合理處方的開發(fā)。納米晶制劑多為口服制劑,但其胃腸道的吸收機(jī)制至今極少報道�，F(xiàn)在一部分研究者認(rèn)為溶解度和溶出速率的增加是納米晶制劑提高生物利用度的最關(guān)鍵因素,也有一些研究人員認(rèn)為納米晶的吸收遵循與其他納米載藥系統(tǒng)類似的原理,即主要以內(nèi)吞的形式被細(xì)胞攝取,然而還缺少令人信服的數(shù)據(jù)來直接支持這些假設(shè),因此有必要對納米晶胃腸道的吸收機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)地研究。全面認(rèn)識和掌握納米晶在胃腸道的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特點和口服吸收機(jī)制,對納米晶口服制劑的合理開發(fā)與優(yōu)化有重要指導(dǎo)作用。為此,本課題開展了系統(tǒng)的納米晶制劑作用機(jī)制研究。首先在細(xì)胞水平上考察納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,闡明基于細(xì)胞表面吸附、細(xì)胞頂膜攝取、細(xì)胞器定位以及細(xì)胞底膜排出的納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理;在此基礎(chǔ)上,從器官水平考察納米晶在不同腸段的運(yùn)輸特點和作用機(jī)制;進(jìn)而在活體動物水平驗證體內(nèi)外結(jié)果的相關(guān)性,得出規(guī)律性結(jié)論。并且在研究納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的同時,還考察了由量變帶來的生物學(xué)效應(yīng)的不同。通過不同層次不同水平的研究,全面闡明納米晶的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特點和口服吸收機(jī)理。本課題研究內(nèi)容和結(jié)果總結(jié)如下:1.三種納米晶三種粒徑的制備。采用沉淀法制備了三種不同粒徑的香豆素-6納米晶,帶正電,呈球形。建立了香豆素-6納米晶的熒光分析方法,線性良好,定量限滿足實驗的需求。采用濕磨法制備了三種不同粒徑的阿瑞匹坦納米晶,帶負(fù)電,呈矩形。建立了阿瑞匹坦納米晶的LC-MS/MS方法,線性良好,定量限滿足實驗的需求。采用濕磨法制備了三種不同粒徑的槲皮素納米晶,帶負(fù)電,呈錐形。三種模型藥的粒徑都約為200 nm、500 nm、3 μm。2.納米晶與細(xì)胞表面吸附環(huán)節(jié)。納米晶可以快速有效地吸附在細(xì)胞表面,并引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用,粒徑越小,與細(xì)胞的吸附作用越強(qiáng),但粘附劑和表面電荷會影響此過程。香豆素-6納米晶帶正電,細(xì)胞吸附呈粒徑依賴。阿瑞匹坦納米晶帶負(fù)電,吸附效率較低,由于制備中引入粘附劑HPC-SL,三個粒徑組的細(xì)胞吸附無顯著性差異。3.納米晶在細(xì)胞頂膜的攝取環(huán)節(jié)。納米晶可以以晶體的形式被細(xì)胞內(nèi)吞,該過程涉及多種蛋白介導(dǎo)途徑,并且呈濃度、時間、粒徑、溫度依賴趨勢;粒徑不僅從速度和程度上影響納米晶的攝取,還影響納米晶的內(nèi)吞方式。微米粒徑的內(nèi)吞更多依賴于巨胞飲,納米粒徑的內(nèi)吞介導(dǎo)途徑更多元化,涉及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞以及巨胞飲,肌動蛋白也參與此過程,這可能是其細(xì)胞攝取效率高的原因。4.納米晶在細(xì)胞內(nèi)的共定位環(huán)節(jié)。納米晶經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞后主要集中于溶酶體內(nèi),大部分被溶酶體代謝,與有關(guān)外排分泌的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位不明顯,跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效率可能并不高。5.納米晶在穿細(xì)胞底膜環(huán)節(jié)。納米晶可以以晶體形式實現(xiàn)穿細(xì)胞過程,細(xì)胞旁路作用不明顯。并且制備成納米晶后,可以顯著改善BCS Ⅳ類藥物的透膜性,粒徑越小,效果越好,其機(jī)制涉及藥物的被動擴(kuò)散和多種蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。但納米晶的整體跨膜效率并不高,可能與納米晶在細(xì)胞內(nèi)較少參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的再修飾有關(guān)。6.采用離體腸外翻模型和在體腸灌流模型研究納米晶的腸道吸收特性。阿瑞匹坦納米晶在十二指腸處有最大吸收,微米粒徑最大吸收在空腸處,納米晶可以在速度和程度上提高藥物的腸道運(yùn)輸。并且隨著藥物濃度的增加,吸收有飽和現(xiàn)象,納米晶增加難溶性藥物的腸道吸收是被動擴(kuò)散和多種蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑共同作用的結(jié)果。7.在活體水平考察了納米晶在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。大鼠給藥不同粒徑的阿瑞匹坦納米晶后,小粒徑納米晶的AUC和Cmax都顯著提高,Tmax縮短,納米晶改善了難溶性藥物的吸收速度和程度,并且粒徑越小,改善程度越高。8.納米晶可以改善難溶性藥物的生物學(xué)效應(yīng)。槲皮素納米晶可以在分子和細(xì)胞水平上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移和侵襲,且具有濃度和時間依賴性,其機(jī)制可能與抑制了STAT3蛋白表達(dá)有關(guān)。并且粒徑越小,作用越明顯,這可能是納米晶增加了其溶解性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的結(jié)果。綜上所述,納米晶可以改善難溶性藥物的口服吸收和生物利用度,這是納米晶增加難溶性藥物的溶解性和透膜性共同作用的結(jié)果,其機(jī)制與藥物在胃腸道的被動擴(kuò)散以及多種蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑有關(guān)。對于滲透性差的BCS Ⅳ類藥物,納米晶不僅可以提高其溶解性,也是改善該藥物透膜性的有效方法,但改善的效率有待進(jìn)一步的提高。針對這一點,可以從納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的具體環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。納米晶與細(xì)胞表面吸附環(huán)節(jié),粒徑減小表面能增大帶來的被動吸附、電荷修飾、粘附劑的添加以及靶向細(xì)胞膜特異受體的配體-受體相互作用等,都可以加強(qiáng)納米晶的細(xì)胞吸附,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用。在納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié),對于細(xì)胞旁路途徑,殼聚糖、聚丙烯酸酯等可打開分子間的緊密連接,增加細(xì)胞間的滲透;對于穿細(xì)胞途徑,一方面可以針對多種內(nèi)吞蛋白介導(dǎo)途徑對納米晶表面進(jìn)行配體修飾,增加內(nèi)吞的效率,另一方面可以將具有溶酶體逃逸功能的材料,如聚乙烯亞胺、樹枝狀聚合物等引入到納米晶結(jié)構(gòu)中,減少納米晶制劑在溶酶體的代謝,提高納米晶的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率,進(jìn)而增強(qiáng)難溶性藥物的口服吸收和生物利用度。本研究探討了納米晶增加難溶性藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和口服吸收的作用機(jī)制,并為納米晶制劑的合理設(shè)計與優(yōu)化提供了重要思路,同時也為納米晶制劑在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。本論文有如下的新發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)新點:1.本課題從細(xì)胞水平、器官水平到活體動物水平三個層面系統(tǒng)地研究了納米晶的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特點和口服吸收機(jī)理,體內(nèi)外驗證了納米晶提高難溶性藥物口服吸收和生物利用度是溶解性和內(nèi)吞作用共同提高的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)為納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和口服吸收的機(jī)理研究,提供了重要的依據(jù)。2.初步闡明了納米晶在細(xì)胞表面吸附、細(xì)胞頂膜攝取、細(xì)胞器定位、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑幾個環(huán)節(jié)的作用方式和特點,針對這些環(huán)節(jié)的影響因素,可以有針對性地優(yōu)化納米晶的設(shè)計,為納米晶的開發(fā)和應(yīng)用提供合理的指導(dǎo)作用。3.明確了亞微米級粒徑對納米晶跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和口服吸收的影響,為納米晶粒徑的選擇和優(yōu)化指明道路。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943
【部分圖文】：

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文中性顆粒比帶電顆粒能更好地穿過黏液層[24]；黏蛋白纖維相互交織結(jié)構(gòu)對于納米顆粒也起到了空間位阻的效應(yīng)[25]。因此，對于納米顆、疏水性和電荷正負(fù)性等性質(zhì)決定了其與黏液層的相互作用和透過能細(xì)胞 黏液層下面是上皮細(xì)胞，細(xì)胞層中有腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和微褶皺細(xì)胞（M 細(xì)胞），細(xì)胞間有緊密連接，細(xì)胞層下為基底層、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)和血管[26]。納米顆粒穿透上皮細(xì)胞屏障需要通過細(xì)胞）或細(xì)胞旁路（細(xì)胞間）途徑，同時可能需要克服外排泵的8]（圖 1.1）。納米顆粒的跨上皮細(xì)胞方式主要有被動擴(kuò)散、主動轉(zhuǎn)運(yùn)，其中 M 細(xì)胞允許顆粒以整體形式通過[29]。顆粒的理化性質(zhì)不同，能不同。而對于細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，納米顆粒經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)需要克服接。細(xì)胞的緊密連接是一種多蛋白復(fù)合體，它在胃腸道上皮細(xì)胞之擇性滲透的閉合小帶[30]。顆粒穿過緊密連接依賴于緊密連接孔徑的連接的形成過程中發(fā)現(xiàn)其完整性依賴于鈣離子，鈣離子去除后可引蛋白重排和孔徑增大，減弱緊密連接的屏障功能[26]。

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文謝酶和 P-gp 共存，大大加強(qiáng)了藥物的代謝，導(dǎo)致藥物的口服生物利用度降低[32]。由此可見，藥物口服生物利用度低的原因可以歸納為：（1）藥物經(jīng)胃腸道化學(xué)作用被破壞，尚未到達(dá)上皮細(xì)胞，生物活性已減弱或消失。（2）藥物的理化性質(zhì)如水/脂溶性、粒徑或相對分子質(zhì)量等不合適，通過胃腸道物理屏障的能力差。（3）藥物是腸道代謝酶或外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物，難以通過胃腸道生化屏障。其中，藥物的溶解性和透膜性是影響藥物口服吸收的關(guān)鍵，對口服藥物的吸收起限速作用[33]。(二) 口服納米給藥系統(tǒng)的胃腸道吸收機(jī)制目前報道的口服納米制劑的主要吸收途徑有以下三種[34]：（1）細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)，（2）穿上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，（3）經(jīng)回腸內(nèi)集合淋巴結(jié)的 M 細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。其中 M 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收被認(rèn)為是口服納米制劑的主要吸收途徑[35]。另外，納米制劑在經(jīng)過胃腸道的過程中，部分藥物可能釋放出來，并同游離藥物一樣被動擴(kuò)散進(jìn)入血液循環(huán)。此外還有其他一些細(xì)胞質(zhì)膜損傷、擠壓吸附和受體介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運(yùn)等吸收途徑[12]，以上機(jī)制可同時運(yùn)轉(zhuǎn)（圖 1.2），構(gòu)成了納米制劑吸收的主要途徑。

的孔徑范圍為 0.3~1.0 nm[36]，即使完全打開，也不超過制劑來說尺寸太窄，無法實現(xiàn)穿越[37]。許多研究表明動態(tài)的，肌動蛋白的收縮、細(xì)胞外鈣離子濃度的降低殼聚糖通過電荷介導(dǎo)作用可使緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)重組[38]，聚丙烯酸酯可降低細(xì)胞外鈣離子的濃度促進(jìn)納米制劑經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)可增加吸收，但轉(zhuǎn)運(yùn)效率并不高。細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)納米顆粒的攝取有吸附、融合、膜間轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)吞等方米顆粒穿細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的主要機(jī)制。納米顆粒的內(nèi)吞作用 1.3），主要包括網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞以及巨被包裹在囊泡中，然后被運(yùn)輸至早期內(nèi)吞體（EEs）。溶酶體中累積并被溶酶體代謝[42]，少量的納米顆粒可分納米顆�？梢酝ㄟ^高爾基體（GC）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）納米顆粒的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是一個復(fù)雜的過程，需要進(jìn)。

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