多種疾病的發(fā)生過程都伴有炎癥反應,全球每年約有上億炎癥患者忍受著病痛的折磨。艾瑞昔布為新型COX-2的選擇性抑制劑,對急性和慢性炎癥具有良好治療作用。最近研究發(fā)現(xiàn),艾瑞昔布與CYP2C9底物藥物聯(lián)用能夠改變其代謝,但其對CYP2C9酶的作用尚不明確,相關體內(nèi)、外實驗的文獻報道結論不一致。有文獻報道,大鼠連續(xù)灌服艾瑞昔布,能使同時服用的甲苯磺丁脲代謝加快,表現(xiàn)出艾瑞昔布對CYP2C9酶的誘導作用;然而,在另一體外肝微粒體實驗中,艾瑞昔布卻表現(xiàn)出對CYP2C9輕微抑制作用。那么,艾瑞昔布對CYP2C9酶究竟是誘導作用還是抑制作用,長期服用是否會對經(jīng)CYP2C9酶代謝的藥物產(chǎn)生影響,這是目前需要明確的問題。本實驗擬通過體內(nèi)、體外兩部分實驗探究艾瑞昔布對CYP2C9酶的影響,并對其作用機制進行初步研究,旨在為艾瑞昔布的臨床合理用以及避免不良藥物相互作用提供理論依據(jù)。第一部分艾瑞昔布對肝微粒體孵育體系中CYP2C9酶的影響目的:建立肝微粒體中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定方法通過測定CYP2C9肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量探究艾瑞昔布對CYP2C9酶活性的影響。方法:UPLC色譜條件:ACQUITY UPLC?BEH-C_(18)色譜柱(2.1×50mm,1.7μm),柱溫30℃,流動相為水-乙腈(V/V=76:24),流速0.4 mL/min,檢測波長235 nm,進樣量2μL,內(nèi)標為卡馬西平。肝微粒體孵育體系500μL,加入甲苯磺丁脲50μM,于37℃水浴中孵育后終止反應,加入卡馬西平工作液5μL混勻,用乙酸乙酯1500μL萃取,取上清液1250μL吹干,甲醇50μL復溶,取上清液,UPLC法測定大鼠肝微粒體孵育體系中甲苯磺丁脲代謝產(chǎn)物4-羥基甲苯磺丁脲的含量;采用單因素法對肝微粒體孵育蛋白濃度與孵育時間進行優(yōu)化,通過加入艾瑞昔布前后肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量變化分析艾瑞昔布對CYP2C9酶功能的影響。結果:1.建立了肝微粒體中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定法,該方法標準曲線方程為:Y=0.1024X-0.0107,在0.3125-20μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好,專屬性、定量下限、精密度和回收率以及穩(wěn)定性均滿足生物樣品檢測要求。2.篩選并優(yōu)化了肝微粒體孵育條件:最終選擇1 mg/mL作為肝微粒體孵育蛋白濃度,以60 min作為肝微粒體孵育時間。3.體外肝微粒體孵育實驗顯示,隨著艾瑞昔布濃度的升高,4-羥基甲苯磺丁脲生成量相對空白組有所降低,擬合結果表明艾瑞昔布對CYP2C9活性的抑制作用劑量依賴性增強,其IC_(50)為74.77μM。小結:本研究建立了大鼠肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量的測定方法,肝微粒體孵育實驗結果表明,艾瑞昔布對大鼠肝微粒體CYP2C9酶有一定抑制作用,但其IC_(50)遠高于臨床血藥濃度,推測在臨床用量下艾瑞昔布對CYP2C9酶的直接抑制作用較弱。第二部分艾瑞昔布對大鼠肝臟中CYP2C9酶的影響及表達的影響目的:測定大鼠連續(xù)灌胃艾瑞昔布后肝臟CYP2C9酶的蛋白與mRNA表達的變化,初步探究艾瑞昔布對CYP2C9酶的影響及其機制。方法:大鼠隨機分組,連續(xù)灌胃不同天數(shù)的艾瑞昔布(10 mg/kg)或等體積的空白溶劑。在最后一次灌胃結束后取出肝臟,運用Western Blot和RT-PCR探究艾瑞昔布對大鼠肝臟CYP2C9酶蛋白及mRNA表達的影響。結果:Western Blot實驗結果顯示,隨著艾瑞昔布灌胃時間的延長,大鼠肝臟CYP2C9條帶逐漸變淺,灌胃第1天、第7天、第14天的CYP2C9蛋白表達分別為對照組的80%、37%和34%,均有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05);PCR實驗結果顯示,隨著艾瑞昔布灌胃時間的延長,大鼠肝臟CYP2C9 mRNA表達明顯降低,灌胃第1天、第7天、第14天CYP2C9酶mRNA表達分別為對照組的65%、35%和34%,均有明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。小結:隨著艾瑞昔布灌胃時間的延長,大鼠肝臟CYP2C9酶的蛋白表達及mRNA表達逐漸降低,蛋白與基因表達結果具有一致性,表明艾瑞昔布可能是通過調(diào)控了mRNA的表達導致酶蛋白合成減少。結論:本研究建立了大鼠肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定方法,篩選、優(yōu)化得到合適的肝微粒體孵育體系。體外肝微粒體實驗表明,艾瑞昔布對大鼠肝微粒體CYP2C9酶具有一定的抑制作用,但其IC_(50)值遠高于艾瑞昔布在臨床用藥時體內(nèi)的血藥濃度,故認為其對CYP2C9酶直接抑制作用較弱。動物整體給藥時,隨著灌胃給予艾瑞昔布時間的延長,大鼠肝臟CYP2C9酶的蛋白表達和mRNA的表達逐漸降低,二者調(diào)控具有一致性,提示艾瑞昔布可能是在轉(zhuǎn)錄過程中影響了mRNA的表達,導致該酶蛋白合成減少。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

18圖 1 超高效液相色譜圖hromatograms of UPLC. A: Blank liver microsomal oxytolbutamide, C: Carbamazepine，D: Tolbutamide, E: Imcal sample 1: 4-Hydroxytolbutamide, 2: Carbamazepine,

圖 2 4-羥基甲苯磺丁脲標準曲線Fig.2 Standard curve of 4-hydroxytolbutamide、高（0.625、2.5、16 μg/mL）三種不同濃度的 4內(nèi)精密度和日間精密度結果見 Table 1。表 1 4-羥基甲苯磺丁脲測定精密度結果（n=5）Table 1 Precision of 4-Hydroxytolbutamidetest (n=5tion)Intra-day Inter-daMean±SD(μg/mL)RSD/%Mean±SD(μg/mL) 0.59±0.04 8.05 0.63±0.05

體系的優(yōu)化白液濃度的選擇磺丁脲的生成量-蛋白液濃度關系分別見 Fig.驗條件范圍內(nèi)，隨著孵育蛋白濃度的增加，4逐漸增加，在 0.3-1 mg/mL 增加明顯，當?shù)鞍谆妆交嵌‰宓漠a(chǎn)量上升變緩，因此，選擇液最佳濃度。

【參考文獻】

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1 貢瑩;何文娟;王偉美;張志清;;探針藥物法評價艾瑞昔布對大鼠CYP2C9酶的影響[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;2015年02期

2 雷旭偉;王雙虎;胡國新;周云芳;;超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定CYP2C9酶活性[J];中國藥師;2014年11期

3 徐東;張奉春;古潔若;徐建華;陶怡;張鳳肖;何培根;鮑春德;肖衛(wèi)國;;艾瑞昔布治療膝骨關節(jié)炎的Ⅲ期多中心隨機雙盲臨床試驗[J];中華臨床免疫和變態(tài)反應雜志;2014年03期

4 華碧春;劉嬌;黃智鋒;史道華;廖華軍;林芳;;黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達影響的實驗研究[J];中藥與臨床;2014年05期

5 沈龍海;安泳潼;尹蓓s

本文編號：2825015