多種疾病的發(fā)生過程都伴有炎癥反應(yīng),全球每年約有上億炎癥患者忍受著病痛的折磨。艾瑞昔布為新型COX-2的選擇性抑制劑,對(duì)急性和慢性炎癥具有良好治療作用。最近研究發(fā)現(xiàn),艾瑞昔布與CYP2C9底物藥物聯(lián)用能夠改變其代謝,但其對(duì)CYP2C9酶的作用尚不明確,相關(guān)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論不一致。有文獻(xiàn)報(bào)道,大鼠連續(xù)灌服艾瑞昔布,能使同時(shí)服用的甲苯磺丁脲代謝加快,表現(xiàn)出艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶的誘導(dǎo)作用;然而,在另一體外肝微粒體實(shí)驗(yàn)中,艾瑞昔布卻表現(xiàn)出對(duì)CYP2C9輕微抑制作用。那么,艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶究竟是誘導(dǎo)作用還是抑制作用,長期服用是否會(huì)對(duì)經(jīng)CYP2C9酶代謝的藥物產(chǎn)生影響,這是目前需要明確的問題。本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)、體外兩部分實(shí)驗(yàn)探究艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究,旨在為艾瑞昔布的臨床合理用以及避免不良藥物相互作用提供理論依據(jù)。第一部分艾瑞昔布對(duì)肝微粒體孵育體系中CYP2C9酶的影響目的:建立肝微粒體中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定方法通過測定CYP2C9肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量探究艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶活性的影響。方法:UPLC色譜條件:ACQUITY UPLC?BEH-C_(18)色譜柱(2.1×50mm,1.7μm),柱溫30℃,流動(dòng)相為水-乙腈(V/V=76:24),流速0.4 mL/min,檢測波長235 nm,進(jìn)樣量2μL,內(nèi)標(biāo)為卡馬西平。肝微粒體孵育體系500μL,加入甲苯磺丁脲50μM,于37℃水浴中孵育后終止反應(yīng),加入卡馬西平工作液5μL混勻,用乙酸乙酯1500μL萃取,取上清液1250μL吹干,甲醇50μL復(fù)溶,取上清液,UPLC法測定大鼠肝微粒體孵育體系中甲苯磺丁脲代謝產(chǎn)物4-羥基甲苯磺丁脲的含量;采用單因素法對(duì)肝微粒體孵育蛋白濃度與孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,通過加入艾瑞昔布前后肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量變化分析艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶功能的影響。結(jié)果:1.建立了肝微粒體中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定法,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.1024X-0.0107,在0.3125-20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,專屬性、定量下限、精密度和回收率以及穩(wěn)定性均滿足生物樣品檢測要求。2.篩選并優(yōu)化了肝微粒體孵育條件:最終選擇1 mg/mL作為肝微粒體孵育蛋白濃度,以60 min作為肝微粒體孵育時(shí)間。3.體外肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)顯示,隨著艾瑞昔布濃度的升高,4-羥基甲苯磺丁脲生成量相對(duì)空白組有所降低,擬合結(jié)果表明艾瑞昔布對(duì)CYP2C9活性的抑制作用劑量依賴性增強(qiáng),其IC_(50)為74.77μM。小結(jié):本研究建立了大鼠肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量的測定方法,肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,艾瑞昔布對(duì)大鼠肝微粒體CYP2C9酶有一定抑制作用,但其IC_(50)遠(yuǎn)高于臨床血藥濃度,推測在臨床用量下艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶的直接抑制作用較弱。第二部分艾瑞昔布對(duì)大鼠肝臟中CYP2C9酶的影響及表達(dá)的影響目的:測定大鼠連續(xù)灌胃艾瑞昔布后肝臟CYP2C9酶的蛋白與mRNA表達(dá)的變化,初步探究艾瑞昔布對(duì)CYP2C9酶的影響及其機(jī)制。方法:大鼠隨機(jī)分組,連續(xù)灌胃不同天數(shù)的艾瑞昔布(10 mg/kg)或等體積的空白溶劑。在最后一次灌胃結(jié)束后取出肝臟,運(yùn)用Western Blot和RT-PCR探究艾瑞昔布對(duì)大鼠肝臟CYP2C9酶蛋白及mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果:Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著艾瑞昔布灌胃時(shí)間的延長,大鼠肝臟CYP2C9條帶逐漸變淺,灌胃第1天、第7天、第14天的CYP2C9蛋白表達(dá)分別為對(duì)照組的80%、37%和34%,均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著艾瑞昔布灌胃時(shí)間的延長,大鼠肝臟CYP2C9 mRNA表達(dá)明顯降低,灌胃第1天、第7天、第14天CYP2C9酶mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的65%、35%和34%,均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。小結(jié):隨著艾瑞昔布灌胃時(shí)間的延長,大鼠肝臟CYP2C9酶的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)逐漸降低,蛋白與基因表達(dá)結(jié)果具有一致性,表明艾瑞昔布可能是通過調(diào)控了mRNA的表達(dá)導(dǎo)致酶蛋白合成減少。結(jié)論:本研究建立了大鼠肝微粒體孵育體系中4-羥基甲苯磺丁脲含量的UPLC測定方法,篩選、優(yōu)化得到合適的肝微粒體孵育體系。體外肝微粒體實(shí)驗(yàn)表明,艾瑞昔布對(duì)大鼠肝微粒體CYP2C9酶具有一定的抑制作用,但其IC_(50)值遠(yuǎn)高于艾瑞昔布在臨床用藥時(shí)體內(nèi)的血藥濃度,故認(rèn)為其對(duì)CYP2C9酶直接抑制作用較弱。動(dòng)物整體給藥時(shí),隨著灌胃給予艾瑞昔布時(shí)間的延長,大鼠肝臟CYP2C9酶的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)逐漸降低,二者調(diào)控具有一致性,提示艾瑞昔布可能是在轉(zhuǎn)錄過程中影響了mRNA的表達(dá),導(dǎo)致該酶蛋白合成減少。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

18圖 1 超高效液相色譜圖hromatograms of UPLC. A: Blank liver microsomal oxytolbutamide, C: Carbamazepine，D: Tolbutamide, E: Imcal sample 1: 4-Hydroxytolbutamide, 2: Carbamazepine,

圖 2 4-羥基甲苯磺丁脲標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of 4-hydroxytolbutamide、高（0.625、2.5、16 μg/mL）三種不同濃度的 4內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果見 Table 1。表 1 4-羥基甲苯磺丁脲測定精密度結(jié)果（n=5）Table 1 Precision of 4-Hydroxytolbutamidetest (n=5tion)Intra-day Inter-daMean±SD(μg/mL)RSD/%Mean±SD(μg/mL) 0.59±0.04 8.05 0.63±0.05

體系的優(yōu)化白液濃度的選擇磺丁脲的生成量-蛋白液濃度關(guān)系分別見 Fig.驗(yàn)條件范圍內(nèi)，隨著孵育蛋白濃度的增加，4逐漸增加，在 0.3-1 mg/mL 增加明顯，當(dāng)?shù)鞍谆妆交嵌‰宓漠a(chǎn)量上升變緩，因此，選擇液最佳濃度。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2825015