研究目的與意義艾滋病是由人類免疫缺陷病毒引起的一種慢性傳染病,目前尚未研制成功有效的艾滋病疫苗,抗HIV-1藥物仍然是治療艾滋病的主要手段。傳統(tǒng)的抗HIV-1藥物主要是針對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶或整合酶的小分子抑制劑,其發(fā)揮作用的靶點(diǎn)是病毒進(jìn)入細(xì)胞后的階段。隨著HIV-1入侵宿主細(xì)胞分子機(jī)制的逐步闡明,阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的HIV-1融合抑制劑逐漸成為艾滋病藥物的研究熱點(diǎn)。恩夫韋肽作為目前唯一被美國FDA批準(zhǔn)的HIV-1融合抑制劑,因體內(nèi)半衰期短和注射頻繁等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用。長效化HIV-1融合抑制劑具有更好的藥代動力學(xué)特性,不僅可以降低藥物的使用頻率,減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),還可以用于預(yù)防高危人群HIV-1的感染。但隨著抗病毒治療藥物的廣泛應(yīng)用,HIV-1在藥物選擇壓力下發(fā)生突變,導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生,致使病毒對藥物敏感性下降或不敏感。聚乙二醇(PEG)修飾通過改善多肽藥代動力學(xué),從而延長藥物半衰期,目前許多PEG化的多肽藥物已用于臨床。本課題與中科院微生物所合作合成了PEG化C34,以發(fā)現(xiàn)阻止HIV-1進(jìn)入細(xì)胞的新一代長效化HIV-1融合抑制劑為最終目的,針對PEG化HIV-1融合抑制劑的耐藥性這一科學(xué)問題,在全面分析其對我國HIV-1臨床分離病毒株藥物敏感性基礎(chǔ)上,深入探討PEG化HIV-1融合抑制劑的耐藥突變位點(diǎn)及其引發(fā)耐藥的機(jī)制,以期為今后藥物設(shè)計提供新的思路。研究方法1.HIV-1病毒株的復(fù)制和制備采集自四川、廣西、北京和安徽的47株中國主要流行亞型HIV-1臨床分離株,兩段法擴(kuò)增HIV-1臨床分離病毒株近全長基因序列,序列拼接、處理后構(gòu)建進(jìn)化樹分析其亞型;分離外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)用于47株臨床分離病毒株的復(fù)制;pNL4-3轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞獲得實驗室適應(yīng)株NL4-3;在TZM-bl細(xì)胞上測定復(fù)制或轉(zhuǎn)染所得病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50)和p24含量。2.基于TZM-bl細(xì)胞的HIV-1融合抑制劑的體外抑制實驗與中科院微生物所合作完成了 PEG化HIV-1融合抑制劑的合成和制備。將T20、C34和PEG修飾的C34(PEG2kC34和PEG5kC34)倍比稀釋后分別與HIV-1包膜蛋白、實驗室適應(yīng)株NL4-3以及47株中國主要流行亞型HIV-1臨床分離株在TZM-bl細(xì)胞上共培養(yǎng)48 h,通過檢測TZM-bl細(xì)胞相對熒光單位值計算PEG化C34對HIV-1包膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和HIV-1復(fù)制的抑制能力。3.PEG修飾前后C34對HIV-1 gp41六螺旋結(jié)構(gòu)形成抑制實驗通過圓二色譜檢測PEG修飾前后C34與靶序列(N36)在195 nm到270 nm波長范圍內(nèi)以及在222 nm處從20℃到98℃溫度范圍內(nèi)的摩爾橢圓率變化,通過計算α-螺旋的百分比和Tm值來確定兩者之間的結(jié)合能力。將終濃度為100 μM的C34或PEG化C34與不同稀釋度的N36在37℃孵育30 min,通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳測定多肽與N36形成六螺旋結(jié)構(gòu)的能力。4.大鼠體內(nèi)PEG化C34半衰期測定選取12只7周齡SD大鼠,隨機(jī)分為3組。單次皮下注射PEG修飾前后C34,在注射前和注射后不同時間點(diǎn)從尾靜脈采血,將倍比稀釋的血漿與NL4-3病毒于TZM-bl細(xì)胞上共培養(yǎng)48 h,通過檢測熒光表達(dá)情況,計算PEG修飾前后C34抑制50%病毒感染的血漿稀釋度。5.PEG化HIV-1融合抑制劑的體外藥物壓力實驗和耐藥位點(diǎn)的鑒定MT2細(xì)胞每3至4天傳代,通過觀察合胞體的形成情況監(jiān)測病毒復(fù)制。在每個病毒突破點(diǎn),抑制劑的濃度加倍。運(yùn)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增不同多肽濃度下病毒gp41序列,通過比對獲得病毒逃逸突變位點(diǎn)。以質(zhì)粒pNL4-3為骨架,利用分子克隆技術(shù)和定點(diǎn)突變試劑盒,構(gòu)建包含突變位點(diǎn)的質(zhì)粒,將測序鑒定正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,測定病毒滴度和p24含量。通過病毒表型耐藥實驗,比較病毒突變前后對PEG化C34和T20的藥物敏感性,確定耐藥位點(diǎn)。6..深度測序檢測體外HIV-1融合抑制劑壓力下病毒的耐藥位點(diǎn)收集體外藥物壓力下病毒培養(yǎng)上清,提取第8、9和10代病毒培養(yǎng)上清RNA,一步法巢式PCR擴(kuò)增HIV-1 gp41基因,純化回收后送北京地壇醫(yī)院傳染病研究所完成測序。7..病毒適應(yīng)性測定將含有PEG化C34耐藥位點(diǎn)的病毒與野生毒株按1:11比例混合后定量感染PM1細(xì)胞,于感染的第3天至第6天收集半量培養(yǎng)液和細(xì)胞,用抗-Thy1.1和抗-Thy1.2抗體染色,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測感染細(xì)胞百分比,確定毒株的相對復(fù)制適應(yīng)性。研究結(jié)果1.PEG化HIV-1融合抑制劑能夠有效抑制我國主要流行亞型HIV-1臨床分離病毒株的復(fù)制,呈現(xiàn)較好的廣譜性。成功合成了兩種PEG化HIV-1融合抑制劑,質(zhì)譜分析其平均分子量分別為6,500 Da和9,300 Da,液相色譜分析其純度均大于98%。敏感性實驗表明PEG化HIV-1融合抑制劑可以有效抑制HIV-1包膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和實驗室適應(yīng)株NL4-3的復(fù)制,對我國主要流行亞型HIV-1臨床分離病毒株特別是占比最高的CRF01 AE亞型毒株具有較好的抑制活性,PEG2kC34和PEG5kC34的EC50平均值分別為19.34 nM和19.64 nM;該類PEG化HIV-1融合抑制劑體外細(xì)胞毒性較低,其CC50均大于100μM。2.PEG化C34通過與NHR結(jié)合形成穩(wěn)定的六螺旋結(jié)構(gòu)抑制病毒包膜蛋白與細(xì)胞膜融合并呈現(xiàn)較長的半衰期圓二色譜結(jié)果顯示兩種PEG化C34均可與HIV-1 gp41相應(yīng)序列結(jié)合,形成高α-螺旋復(fù)合物,PEG2kC34與N36形成93.90%α-螺旋,PEG5kC34與N36形成96.58%α-螺旋;復(fù)合物N36/PEG2kC34和N36/PEG5kC34的熔解溫度分別為57.03 ℃和55.04 ℃。非變性凝膠電泳結(jié)果顯示,與C34相似,PEG修飾后的C34同樣可以與N36結(jié)合形成穩(wěn)定的六螺旋結(jié)構(gòu),并且在一定范圍內(nèi)這種結(jié)合與N36具有劑量依賴關(guān)系。此外,PEG修飾使C34在SD大鼠體內(nèi)半衰期顯著延長。3.L44V和N126K位點(diǎn)同時出現(xiàn)增強(qiáng)了病毒對PEG化C34的耐藥性壓力實驗中多肽C34、PEG2kC34和PEG5kC34的最終濃度分別為其起始濃度的4.096倍、1,024倍和512倍。經(jīng)過7個月篩選,獲得三株HIV-1耐藥株。其突變發(fā)生在gp41的第44、126和250位氨基酸。在C34壓力下,第9代開始出現(xiàn)之前未報道的L44V突變位點(diǎn),N126K突變位點(diǎn)則在更早期的第5代開始出現(xiàn);在PEG2kC34壓力下,L44V和N126K突變同時在第4代出現(xiàn);在PEG5kC34壓力下,本實驗中未檢測L44V或者N126K突變位點(diǎn),但在第7代檢測到R250Q突變位點(diǎn)。L44V或N126K突變可導(dǎo)致PEG2kC34和PEG5kC34的藥物敏感性降低4.2倍和2.3倍或1.2倍和1.6倍,而L44V和N126K雙位點(diǎn)突變后病毒的藥物敏感性降低了 12.4倍或9.8倍。10E8抗體對含突變位點(diǎn)病毒株的中和實驗結(jié)果表明,耐藥位點(diǎn)對gp41結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。因此,我們推測PEG化C34的耐藥性需要L44V和N126K共同維持。4.L33S和R271K位點(diǎn)同時出現(xiàn)增強(qiáng)了PEG化T20的耐藥性Gp41區(qū)只出現(xiàn)L33S突變位點(diǎn)時,T20、PEG2kT20和PEG5kT20的EC50均有較大改變,但改變程度存在差異,其EC50分別變?yōu)樵瓉淼?2倍、83倍以上和28倍;Gp120區(qū)只出現(xiàn)R271K突變位點(diǎn)時,抑制劑的EC50變化較小,且抑制劑間差異也較小,分別變?yōu)樵瓉淼?～3倍;L33S和R271K同時突變時抑制劑的EC50表現(xiàn)出較之前兩位點(diǎn)單獨(dú)突變時更大的差異,抑制劑的EC50均變?yōu)樵瓉淼?3倍以上,即gp120區(qū)的R271K能夠增強(qiáng)L33S的耐藥性,之前我們未見相關(guān)報道。T20耐藥株對PEG修飾T20的交叉耐藥實驗結(jié)果顯示,T20耐藥性與PEG2kT20或PEG5kT20存在差異,其中NL4-3-V38A、NL4-3-V38E-N42S、NL4-3-V38A-N42D和NL4-3-V38A-N42T對T20、PEG2kT20和PEG5kT20均表現(xiàn)出了不同程度的耐藥;而NL4-3-N43K對T20和PEG5kT20表現(xiàn)出一定程度的耐藥但本課題中未觀察到其對PEG2kT20的耐藥現(xiàn)象。HIV-1 gp41基因深度測序,檢測到多個組內(nèi)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn),并且PEG化C34和T20的耐藥性存在差異。5.N126K突變位點(diǎn)顯著降低病毒的相對復(fù)制適應(yīng)性流式細(xì)胞儀檢測AT1和含耐藥位點(diǎn)AT2病毒株的相對復(fù)制適應(yīng)性。實驗結(jié)果顯示,L44V、N126K和R250Q均可以在不同程度上降低病毒的相對復(fù)制適應(yīng)性,其中N126K突變可顯著影響病毒的相對復(fù)制適應(yīng)性,但該顯著性在溶液中存在C34的情況下消失。結(jié)論P(yáng)EG化HIV-1融合抑制劑可以有效抑制HIV-1 env介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和實驗室適應(yīng)株NL4-3的復(fù)制,對我國主要流行亞型HIV-1臨床分離病毒株也具有較好的抑制廣譜性,在SD大鼠體內(nèi)的半衰期顯著延長。N126K和L44V位點(diǎn)同時出現(xiàn)能夠增強(qiáng)PEG化C34耐藥性,N126K突變位點(diǎn)能夠顯著降低病毒的相對復(fù)制適應(yīng)性;與PEG化C34不同,PEG化T20的主要耐藥位點(diǎn)是L33S,L33S和R271K同時出現(xiàn)能增強(qiáng)其耐藥性。本研究為長效化HIV-1融合抑制劑的耐藥性及作用機(jī)制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

Ｐｏｌ結(jié)構(gòu)蛋白可以編碼蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、ＲＮＡ酶Ｈ和整合酶；Ｅｎｖ結(jié)構(gòu)蛋白在逡逑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上可以被酶切為ｇｐｌ２０和ｇｐ４１［ｌｌ］，ｇｐｌ２０可以介導(dǎo)病毒輔助受體與ＣＤ４逡逑的結(jié)合，而ｇｐ４１主要參與融合過程（圖２）。逡逑ＬＴＰ邐ｖｌｆ邐ｖｐｕ邐ｉ邋ａｎｖ邐ｎｅｆ逡逑Ｋ東螓》＊／ｔＷ邐ｍr>感染Ｉｔ因７，ｐ２３＞邐？？？白Ｕ邐白邐負(fù)＊控子＜ｐ２心逡逑＊＞包含ａ合？主？呆因邐＊X/雇＊主因Ｔ的抑邐0邋ｔｔ進(jìn)ＣＤｉＷ邋0在內(nèi)廟Ｈ上《＿Ｗ）為邋＊促《萑主坩Ｗ＊面的逡逑子的ｗａｔ＊？產(chǎn)生史多挖＊邐ｗ．邋ｋｗ�。澹纾鹭ǹ�00ｊｉ邐ｃｄ４及ｍｈｃ丨表達(dá)下？逡逑？邋Ｗ錄ｔｅ？所＊＊邐的ＲＴ＊合夢邐《？粒的釋放邐？邋ａｐ丨２（）介異供寓與ＣＤ丨＊甩止＊亡逡逑？笆含結(jié)合邋Ｔａｌ邋的邋ＲＮＡ邋反邐《？��？？？！邋枝的從▲邋？？？？�。保�？？逡逑式S不鈑Υ鷦媯翦澹簦幔潁危徨�？改Y 曲物澈活的狀？逡逑－９Ｐ４Ｉ介�。藓线�？《少Ｎｅ枈發(fā)播逋度逡逑？邋ｆ９＾Ｓ８＊Ｒｅｖ？ＲＮＡ逡逑，ａ＊７ｔ？邋－ＲＲ６．邋Ｌ逡逑５－ｒ0３Ｂｕ５Ｍｆｉ＾＊ａａ６邐■邐｜－＊Ｕ３Ｑｕ５｜邋３．逡逑邐邐Ｉ邐｜邐—邐■邋Ｔ邋－邐＿逡逑ｇａｇ邐ｐｏｌ邐ｖｐｒ邐ｒｅｖ邐ｔａｔ逡逑Ｐ５５蠹白邐多《＿邐供榛隹白Ｒ邋ｆｐｌ５＞邐Qy蹦潔錒锏骺刈渝遄蛹せ鈄印穡歟�，辶x�？多１Ｃ＊白．r罃傆桑�？邋？钿Z嗌耩昵菽皰澹僦擔(dān)眄駉w？衣《邐＾ｐｌ＊？？邐＊結(jié)合ＴＡＲ逡逑Ｓ白由《９切？４神�。妫榘走�？包《？白拍《＿的＃擔(dān)財?邐》？含ＲＱＥ邐■與有生細(xì)胙的閣明逡逑■邋ＭＡ＃？＊邋白邋‘ｐｌ７

ＣＨＩＮｉ＾逡逑圖１中國ＨＩＶ－１流行亞型比例分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｌｌ邋ＨＩＶ－１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：邋ＣＨＩＮＡ逡逑特征逡逑－１顆粒呈球形，直徑約１２０邋ｍｎ［９ｊ，有包膜。其基因組長９．２－９．８邋ｋｂ，兩端為長末端重復(fù)序列（Ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｒｅ的編碼基因，排列緊湊，部分區(qū)域重疊，編碼結(jié)構(gòu)蛋白ｔａｔ和ｒｅｖ及附屬蛋白ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ和ｖｐｕ［１Ｇ］。其中蛋白（ｐｌ７）、ＣＡ衣殼蛋白（ｐ２４）、ＮＣ核衣克蛋白（以編碼蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、ＲＮＡ酶Ｈ和整合酶；Ｅｎｖ酶切為ｇｐｌ２０和ｇｐ４１［ｌｌ］，ｇｐｌ２０可以介導(dǎo)病毒輔助１主要參與融合過程（圖２）。逡逑

ＤＮＡ形式后整合到宿主細(xì)胞ＤＮＡ中；經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯過程表達(dá)病毒蛋白成分，經(jīng)組裝形成新的病毒粒子并釋放出細(xì)胞［１２］。ＨＩＶ－１的高突變與頻致其核苷酸序列呈多樣性，增加了疫苗研制的困難，目前治療ＨＩＶ－１的是研發(fā)安全高效的抗ＨＩＶ－１藥物。作用于ＨＩＶ－１復(fù)制周期不同階段藥物包括ＨＩＶ－丨融合抑制劑、輔助受體抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（核苷酶抑制劑和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑）、蛋白酶抑制劑和整合酶抑制劑（至２０１８年４月１２日，美國ＦＤＡ批準(zhǔn)的抗ＨＩＶ藥物共４０種，包括１３逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、６種非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、１１種蛋白酶抑制劑、合酶抑制劑、１種融合抑制劑、１種輔助受體抑制劑和５種組合藥ｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＦｏｒＰａｔｉｅｎｔｓ／Ｉｌｌｎｅｓｓ／ＨＩＶＡＩＤＳ／Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｕｃｍ邋１１８９１５．ｈｔｍ）。研發(fā)的不斷深入，作用于新的靶點(diǎn)或具有新的作用機(jī)制的藥物將不斷被Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ逡逑

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1 王琛;PEG化HIV-1融合抑制劑的耐藥性和作用機(jī)制研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2019年

本文編號：2813727