O-GlcNAc修飾是一種細胞內廣泛存在的翻譯后修飾,對細胞的許多生理機制都有重要的調節(jié)作用,異常的O-GlcNAc修飾與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展及其它人類重大疾病存在著密切關系。目前常用的O-GlcNAc修飾的檢測方法是依賴抗體進行的免疫組化染色或western-blot檢測,雖然準確,但步驟繁瑣,不適用于大批樣品的檢測以及抑制劑的篩選。此外,有人在代謝標記法的基礎上引入FRET(熒光共振能量轉移)技術,能夠進行O-GlcNAc修飾的成像與檢測,但是此類方法中有的只能進行細胞外檢測,有的需要引入特殊化合物容易引起細胞毒性,適用性不高。所以需要一種方法,能夠方便準確地檢測O-GlcNAc修飾并且還可進行相關抑制劑的高通量篩選。我們以轉錄調控為作用原理,構建了一個熒光報告分子可以在細胞保持生理活性的狀態(tài)下進行O-GlcNAc修飾水平的檢測。該報告分子主要包括三個組分,一個是功能上受O-GlcNAc修飾影響的轉錄因子NeuroD1,另一個是胰島素啟動子(IP)驅動表達的增強型綠色熒光蛋白(eGFP)作為報告基因(IG),其中IP受NeuroD1的調控,第三個組分是由CMV啟動子驅動表達的紅色熒光蛋白(RFP)作為內參基因(CR)。報告基因和內參基因之間插入轉錄終止信號和翻譯終止密碼子,使兩者相互獨立。將NeuroD1通過P2A(一段自我剪切肽鏈)連在RFP下游,使NeuroD1和RFP共用一個CMV啟動子,但利用P2A將兩個蛋白彼此分開,各自發(fā)揮功能。我們驗證了熒光報告分子(IGCRN)的功能,可以準確檢測細胞內O-GlcNAc修飾水平下調的情況,還可以響應不同濃度的OGT抑制劑OSMI-1和HBP通路的抑制劑DON。同時,我們還用IGCRN檢測了OSMI-1和DON的EC50,分別是5.93μM和33.08μM。我們希望可以利用IGCRN穩(wěn)定表達的細胞系,進行OGT和HBP通路抑制劑的高通量篩選。
【學位單位】：南開大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R91
【部分圖文】：

O-GlcNAc修飾（Hongiketal,2018）

HBP通路（Yangetal,2015）

第一章 前言初發(fā)現(xiàn)于口蹄疫病毒（FMDV）當中，位于小核糖核酸病毒兩種蛋白質之間。后來又在許多不同類型的病毒中發(fā)現(xiàn)了其 2A 序列，包括 P2A（porcine teschovirus-1 2A），T2A（Thosea （equine rhinitis A virus 2A），BmCPV 2A（cytoplasmic polyhe BmIFV 2A（flacherie virus 2A）。2A 具有一段高度保守X)NPGP-，其中 X 代表任意一種氨基酸。其切割位點位于這酸（G）和脯氨酸（P）之間，自我切割后，切割位點的 N 端蛋白質相連接，而最后一個果仁糖殘基則保留在原來的下游的 2A 殘基可以通過弗林蛋白酶去除。自我剪切機制見下圖

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本文編號：2813430