背景與目的:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),又稱冰毒,目前已經(jīng)成為全球第二位濫用毒品,甲基苯丙胺濫用構(gòu)成我國一個日益嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)生物學(xué)和社會學(xué)問題,對我國的和諧社會造成了巨大的威脅~([1,2])。METH主要作用于中腦-邊緣-多巴胺系統(tǒng),對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮作用,由于其高神經(jīng)毒性和成癮性,可以造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重損傷,而METH神經(jīng)毒性作用機制之一為谷氨酸(Glutamate,Glu)興奮性毒性。METH與多巴胺(dopamine,DA)受體結(jié)合使胞外谷氨酸濃度增加,產(chǎn)生興奮性毒性,對神經(jīng)元造成損傷~([3,4])。超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(Hyperpolarizationactivated and cyclic nucleotide-gated,HCN),該通道具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)節(jié)律和突觸可塑性等重要功能~([5])。前期研究表明,HCN通道可能參與了濫用物質(zhì)所致神經(jīng)毒性相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展~([6-8])。METH是否作用于HCN通道,HCN通道是否有可能成為防治METH神經(jīng)毒性的藥物靶標(biāo)。實驗方法:體外實驗檢測HCN通道是否參與METH所致神經(jīng)損傷。通過長期小劑量腹腔注射METH,建立METH所致大鼠神經(jīng)損傷刻板行為模型,按照大鼠刻板行為評分標(biāo)準(zhǔn),以大鼠出現(xiàn)重復(fù)的嗅探、搖頭、抬頭和旋轉(zhuǎn)等刻板行為癥狀,評分結(jié)果大于或等于2分為模型建立成功,通過側(cè)腦室給藥HCN通道拮抗劑觀察對神經(jīng)刻板行為逆轉(zhuǎn)作用。體外實驗檢測METH對通道蛋白表達及功能影響。METH神經(jīng)損傷模型大鼠,經(jīng)麻醉、灌流、斷頭取腦、固定,蔗糖梯度脫水后進行冰凍切片。通過免疫熒光和蛋白免疫印跡技術(shù),觀察刻板行為模型中海馬和伏隔核腦區(qū)HCN1蛋白表達。采用離體腦片全細胞電流鉗記錄技術(shù),向神經(jīng)元細胞注射變化的電流刺激(-300 pA至50 pA,50 pA間隔)步階刺激,經(jīng)METH所致神經(jīng)損傷后,記錄離體腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元電位變化,明確甲基苯丙胺是否直接作用于HCN通道。采用離體腦片全細胞電壓鉗記錄技術(shù),向神經(jīng)元細胞注射超極化電壓步階(-50 mV至-120 mV,10 mV間隔)刺激,給METH所致神經(jīng)損傷后,觀察METH對大鼠離體腦片海馬CA1區(qū)HCN通道電流影響。進一步明確HCN參與調(diào)控METH所致谷氨酸神經(jīng)興奮性毒性。采用離體腦片,采用電生理Gap-Free模式,5μM METH+20μM ZD7288灌流離體腦片后,記錄大鼠離體腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元微小興奮性突觸后電位變化。實驗結(jié)果:通過實驗大鼠腹腔注射10 mg/kg METH,觀察到其刻板行為評分大于或等于2分,結(jié)果顯示成功構(gòu)建METH所致刻板行為模型。預(yù)處理HCN阻滯劑5μg/kg ZD7288側(cè)腦室給藥后,結(jié)果表明HCN通道拮抗劑ZD7288可以逆轉(zhuǎn)METH導(dǎo)致的大鼠刻板行為。免疫熒光方法和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示METH造模大鼠的海馬、伏隔核HCN1蛋白表達上調(diào)。體外電生理結(jié)果顯示METH增加HCN通道電流幅度和HCN sag膜電位。HCN降低METH所致谷氨酸興奮性毒性,減少谷氨酸介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電位。結(jié)論:HCN通道非選擇性阻斷劑ZD7288能逆轉(zhuǎn)METH所致大鼠刻板行為,METH與HCN通道具有相關(guān)性。METH上調(diào)海馬CA1區(qū)和伏隔核區(qū)HCN1亞基蛋白表達水平。METH直接作用于HCN通道,增強HCN通道功能。HCN通道阻斷劑具有緩解METH所致神經(jīng)元興奮性毒性作用,HCN通道參與調(diào)控METH所致神經(jīng)毒性。
【學(xué)位單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R99
【部分圖文】：

μg/kg ZD7288 后，大鼠自發(fā)活性略微增強，但無明顯刻板行為，刻板行為評分為（0.8±1.2）分（見圖 1A）。亞急性 10 mg/kg METH 處理能導(dǎo)致大鼠明顯的刻板行為[65]，腹腔注射 10 mg/kg METH 后，出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)圈、搖頭、嗅探等刻板行為表現(xiàn)，刻板行為評分大于2 分。其中單獨給藥 5 μg/kg ZD7288 組后大鼠自發(fā)活性低于1 μg/kg ZD7288 給藥組，此外 5 μg/kg ZD7288 與給藥 METH 組相比自發(fā)活性明顯明顯較低（見圖 1B）（n=25，*P<0.05，單因素方差分析及 Bonferroni 檢驗）。因此選 5 μg/kg ZD7288 作為預(yù)處理給藥劑量。HCN 通道是一類大分子膜蛋白，參與調(diào)控人體眾多生理功能，HCN離子通道參與調(diào)節(jié)人體多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近幾年 HCN 通道作為藥物作用靶點成為熱點。HCN 通道功能是通過激活或抑制通道開放實現(xiàn)的，本實驗選擇 HCN 通道非選擇性阻斷劑 ZD7288 作為工具藥抑制通道功能，影響離子通道基本電生理特性和通道自身對離子滲透的高度選擇性。通過觀察神經(jīng)疾病病理狀態(tài)下 HCN 通道表達變化，明確HCN 通道參與調(diào)控神經(jīng)疾病病理生理過程，進而揭開疾病發(fā)生發(fā)展機制，同時有利于設(shè)計和開發(fā)治愈神經(jīng)疾病的離子通道藥物。

CN 通道阻斷劑對甲基苯丙胺所致刻板行為的影響METH 亞急性處理組中，進行連續(xù)給藥 4 天的亞急性處理。試驗結(jié)果顯示，給藥，大鼠表現(xiàn)為活動增多，豎毛、豎尾、反復(fù)的向前探索、旋轉(zhuǎn)、倒退等刻板行為性增強等；第 2 天、第 3 天及第 4 天大鼠給藥后表現(xiàn)為活動相對減少，迅速旋轉(zhuǎn)等刻板行為減少，癥狀表現(xiàn)多以呆滯，原地搖頭、反復(fù)的向前探索等輕度刻板隨著給藥時間的延長，大鼠刻板行為逐漸由重度探索轉(zhuǎn)為中度或輕度癥狀表現(xiàn)。H（10 mg/kg，i.p.）亞急性處理中，提前 30 min 給大鼠注射側(cè)腦室 ZD7288（，劑量與鹽水組組相同）出現(xiàn)減緩的急速搖頭、倒退和旋轉(zhuǎn)等重度癥狀減少或間很短的行為表現(xiàn)，緩解 METH 所致的刻板行為（見圖 2）。(n=10, Mean±S.E一個重復(fù)測量的雙因素方差分析及 Bonferroni 檢驗 )。結(jié)果表明，HCN 通道阻斷ETH 所致神經(jīng)損傷刻板行為，HCN 通道可能參與了調(diào)節(jié) METH 引起的神經(jīng)毒性通過調(diào)控HCN 通道功能可以對 METH 神經(jīng)毒性進行干預(yù)。

ETH 上調(diào)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元 HCN1 亞基蛋白表達PA 染細胞核后的藍色熒光鏡像；B：METH 模型組與鹽水組相比大鼠海 HCN1 亞基蛋白綠色熒光增強；C：蛋白免疫印跡顯示，HCN1 亞基蛋白馬 CA1 區(qū)高表達。（Mean±S.E.M.，采用獨立樣本 T 檢驗分析組間差異， METH vs.NS） 3 METH up-regulates the expression of HCN1 subunit in hippocampal Cs blue fluorescence image of nucleus stained by DIPA; B:The green fluorescencesubunit protein in hippocampal CA1 region was enhanced in METH model groed with saline group; C:The expression of HCN1 subunit protein in hippocamegion was significantly higher in protein immunoblotting. (Mean +S.E.dent sample T test was used to analyze the differences between groups,*P < 0. vs. NS)

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7 孫R

本文編號：2812775