【摘要】：癌癥仍然是全世界人類死亡的主要原因之一,在女性中,乳腺癌是最常見的癌癥類型。目前,癌癥的治療方法主要包括手術(shù),化療,放射治療和中醫(yī)治療。在實(shí)際治療計(jì)劃中,經(jīng)常組合兩種或更多種治療以實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。使用化學(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的化學(xué)療法是最廣泛使用的癌癥治療方法。但是單純的化療藥物往往效果較差或者毒副作用大,近年來納米技術(shù)的發(fā)展為化療藥物的遞送提供了一種有效的方法。目前,納米技術(shù)在藥物輸送中的應(yīng)用研究主要包括三類:前藥、納米材料包載原料藥、藥物-材料連接復(fù)合物。綜合考慮靶向遞送能力以及藥物控釋性能,本課題選擇制備藥物-材料連接復(fù)合物,以紫杉醇為模型藥物,通過二硫鍵將其與mPEG-NH2、FA-PEG-NH2相連,形成mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX兩種藥物-材料連接復(fù)合物,這兩種復(fù)合物具有兩親性結(jié)構(gòu),當(dāng)遇到水溶液時(shí)便發(fā)生自組裝行為,形成混合膠束結(jié)構(gòu)。膠束具有氧化還原敏感性和腫瘤靶向性。因?yàn)槟[瘤部位存在實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability andretention effect,EPR effect),所以膠束可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位的聚集,隨后膠束表面的葉酸(folic acid,FA)與腫瘤細(xì)胞膜表面的葉酸受體(folate receptor,FR)特異性地發(fā)生結(jié)合,通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將膠束內(nèi)吞至腫瘤細(xì)胞中。腫瘤細(xì)胞內(nèi)部谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量異常高于正常組織,因此可以進(jìn)入膠束內(nèi)部引起連接臂-二硫鍵的斷裂,由此,紫杉醇原料藥被釋放出來并發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題的研究?jī)?nèi)容主要包含四部分:(1)mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX兩種藥物-材料連接復(fù)合物的合成和表征;(2)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE(MFF)混合膠束的制備及其理化性質(zhì)考察;(3)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn);(4)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束的體內(nèi)分布以及抗腫瘤效果研究。主要研究過程與結(jié)果如下:(1)mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX兩種藥物-材料連接復(fù)合物的合成和表征:首先合成高反應(yīng)活性的3,3'-二硫代二丙酸酐(Dithiodipropionicanhydride,DTDPA),通過核磁共振氫譜(1H-NMR)和熔點(diǎn)測(cè)定確認(rèn)結(jié)構(gòu)和熔點(diǎn),并通過核磁共振氫譜法(1H-NMR)以及熔點(diǎn)測(cè)定法驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)和熔點(diǎn);隨后將DTDPA連接到紫杉醇2'位羥基上,得到PTX-SS-COOH,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)采用高效液相色譜法(HPLC)、傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)和核磁共振氫譜法(1H-NMR)進(jìn)行驗(yàn)證。最后將PTX-SS-COOH和mPEG-NH2、、FA-PEG-NH2相連,即得到mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX,產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)和核磁共振氫譜法(1H-NMR)進(jìn)行驗(yàn)證。得到的mPEG-SS-PTX和FA-PEG-SS-PTX中紫杉醇的接枝率分別為47%和74%。(2)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束的制備及其理化性質(zhì)考察:使用乳化透析法制備混合膠束,用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering,DLS)和透射顯微鏡法(transmission microscopy,TEM)考察膠束的粒徑、電位和形態(tài)。并使用單因素法篩選了油水相體積比、FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX質(zhì)量比以及FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX質(zhì)量比對(duì)膠束的粒徑、Zeta電位和形態(tài)的影響,根據(jù)結(jié)果選取了油水相體積比為2:15、FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為 50%、、FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為10%用于后續(xù)膠束的制備,所得膠束的粒徑為96.42±6.38nm,Zeta電位為-2.53±0.51。隨后使用芘-熒光探針法考察了混合膠束的臨界膠束濃度(critical micelle concentration,CMC),結(jié)果為0.0163mg/ml。通過透析袋法研究了混合膠束的體外釋放行為。設(shè)置對(duì)照組加入lOmM D,L-二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)用于模擬腫瘤部位的高還原性環(huán)境,結(jié)果表明,添加DTT的實(shí)驗(yàn)組的釋放速率和累積釋放量顯著增加。這表明膠束具有明顯的氧化還原敏感性。(3)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):首先以人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)為模型細(xì)胞,采用熒光顯微鏡法再次考察了FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX質(zhì)量比和FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX質(zhì)量比對(duì)膠束攝取以及熒光成像的影響,結(jié)果顯示FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為50%時(shí),葉酸陽性組和陰性組的熒光亮度差別最大,說明在此比例下,FA的主動(dòng)靶向性最好,所以選擇FA-PEG-SS-PTX/mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為 50%。而 FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為10%時(shí),其熒光強(qiáng)度較20%時(shí)更強(qiáng),更利于觀察,所以選取FITC-PEG-DSPE/FA-PEG-SS-PTX+mPEG-SS-PTX質(zhì)量比為10%。通過使用鼠黑素瘤細(xì)胞(B16細(xì)胞)和MCF-7細(xì)胞作為模型細(xì)胞來研究每個(gè)制劑組的細(xì)胞毒性,混合材料組的細(xì)胞存活率始終高于80%,表明該材料具有良好的安全性。mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束組的細(xì)胞存活率具有明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性,隨著劑量的增加,其抗腫瘤效果比紫杉醇原料藥效果要好。為了考察膠束表面葉酸的靶向性,使用流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)考察了mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束對(duì)于葉酸表達(dá)水平不同的人肺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)和MCF-7細(xì)胞的靶向能力的差異,結(jié)果顯示,MCF-7細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度較A549細(xì)胞中的約強(qiáng)10倍,表明該膠束具有較好的葉酸靶向性。(4)mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束的體內(nèi)分布以及抗腫瘤效果研究:以雌性昆明小鼠荷瘤B16細(xì)胞建立腫瘤動(dòng)物模型,當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約150mm3左右時(shí)開始進(jìn)行給藥。每?jī)商旖o藥一次并測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重,14天后處死小鼠,并取心肝脾肺腎和腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)考察膠束的生物安全性。同樣方法給藥一定時(shí)間后采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)(optical in vivo imaging,OI)考察膠束的體內(nèi)分布情況和腫瘤靶向性。腫瘤體積變化曲線顯示mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束具有良好的抗腫瘤效果。體重變化顯示原料藥組在治療后期體重明顯下降,但是mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束組與生理鹽水組均無明顯變化。HE染色顯示,混合膠束組相比于原料藥組和生理鹽水組具有更大面積的粉紅色炎癥區(qū)域,表明混合膠束的良好抗腫瘤效果。而其他組織的HE染色結(jié)果顯示,混合膠束組的組織相比于生理鹽水組沒有明顯的毒副作用。綜上,制備的mPEG-SS-PTX/FA-PEG-SS-PTX/FITC-PEG-DSPE混合膠束相比于原料藥具有高效、低毒的抗腫瘤效果。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943
【圖文】：

圖１課題設(shè)計(jì)簡(jiǎn)略圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ａｂｓｔｒａｃｔ邋ｇｒａｐｈ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｊｅｃｔ逡逑２．課題主要研究?jī)?nèi)容逡逑（１）邐ＦＡ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＰＴＸ、ｍＰＥＧ－ＳＳ－ＰＴＸ邋的合成及表征逡逑第一步是將３，３－二硫代二丙酸在乙酰氯中回流２ｈ得到對(duì)應(yīng)酸酐，通過核磁逡逑共振氫譜以及熔點(diǎn)測(cè)定確定酸酐的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。隨后將制得的酸酐與紫杉醇原料逡逑藥在吡啶和ＤＭＡＰ的作用下進(jìn)行酯化反應(yīng)，將二硫鍵引入到紫杉醇的結(jié)構(gòu)中得逡逑到ＰＴＸ－ＳＳ－ＣＯＯＨ，通過高效液相色譜法、紅外光譜法以及核磁共振氫譜法進(jìn)行逡逑結(jié)構(gòu)表征。得到的邋ＰＴＸ－ＳＳ－ＣＯＯＨ邋與邋ｍＰＥＧ－ＮＨ２、ＦＡ－ＰＥＧ－ＮＨ２邋在邋ＥＤＣ、ＮＨＳ邋的逡逑作用下發(fā)生酰胺化反應(yīng)合成ＰＴＸ－ＳＳ－ｍＰＥＧ和ＰＴＸ－ＳＳ－ＰＥＧ－ＦＡ，使用透析袋法逡逑

如圖１－３所示，產(chǎn)物ＤＴＤＰＡ的核磁共振氫譜圖中，２．５２邋ｐｐｍ處的為乙酰氯逡逑中的甲基氫的吸收峰；１．０３邋ｐｐｍ和３．４０邋ｐｐｍ的分別為乙醚的甲基和亞甲基氫吸逡逑收峰；兩者為殘留溶劑產(chǎn)生的吸收峰。而２．５９邋ｐｐｍ和２．９１邋ｐｐｍ的是酸酐中的亞逡逑２５逡逑

如圖１－３所示，產(chǎn)物ＤＴＤＰＡ的核磁共振氫譜圖中，２．５２邋ｐｐｍ處的為乙酰氯逡逑中的甲基氫的吸收峰；１．０３邋ｐｐｍ和３．４０邋ｐｐｍ的分別為乙醚的甲基和亞甲基氫吸逡逑收峰；兩者為殘留溶劑產(chǎn)生的吸收峰。而２．５９邋ｐｐｍ和２．９１邋ｐｐｍ的是酸酐中的亞逡逑２５逡逑

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本文編號(hào)：2800687