【摘要】：亞甲藍(lán)(methylene blue,MB)是一種吩噻嗪鹽,臨床上用來(lái)治療高鐵血紅蛋白血癥及氰化物中毒等�，F(xiàn)有研究表明,MB具有抗氧化和線(xiàn)粒體保護(hù)的作用,可減輕缺血再灌注引起的氧化損傷,并且MB線(xiàn)粒體保護(hù)的分子機(jī)制與上調(diào)Nrf2/ARE基因有關(guān)。HO-1作為Nrf-2的下游產(chǎn)物,是細(xì)胞防御中的關(guān)鍵酶,能減少傷害性刺激誘導(dǎo)的炎癥和氧化損傷,在ROS對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)中起著關(guān)鍵的作用。本課題的目的是研究MB在過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H_2O_2)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7氧化損傷中起到的保護(hù)作用,并闡明其保護(hù)作用與HO-1蛋白之間的聯(lián)系。本課題以H_2O_2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型,用不同濃度的MB對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理和后處理。通過(guò)MTT和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)細(xì)胞損傷程度;通過(guò)活性氧(reactive oxygen species,ROS)濃度、H_2O_2活性、超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase,SOD)活性和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)生成量檢測(cè)細(xì)胞的氧化損傷;同時(shí),用高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀檢測(cè)線(xiàn)粒體膜電位(Mitochondrial membrane potentia,MMP)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度評(píng)價(jià)線(xiàn)粒體功能;最后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和測(cè)定半胱天冬酶-3蛋白表達(dá)和活性來(lái)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,0.1和1μM濃度的MB預(yù)處理和后處理均能在H_2O_2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷中起到保護(hù)作用,尤其是0.1μM濃度的MB預(yù)處理治療效果最好,表現(xiàn)為有效減輕細(xì)胞損傷、增強(qiáng)線(xiàn)粒體功能和減少細(xì)胞凋亡。為了闡明MB在RAW264.7細(xì)胞氧化損傷中的保護(hù)作用與HO-1蛋白之間的聯(lián)系,首先對(duì)HO-1蛋白表達(dá)和活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示0.1和1μM濃度的MB預(yù)處理和后處理均能增加RAW264.7細(xì)胞中HO-1的蛋白表達(dá)水平。然后利用HO-1 siRNA以及HO-1活性抑制劑鋅原卟啉抑制HO-1蛋白表達(dá)和酶活性。結(jié)果顯示,HO-1 siRNA和鋅原卟啉明顯降低了MB在抵御H_2O_2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體損傷中的有益作用,說(shuō)明了MB對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用主要依賴(lài)于HO-1。總之,MB通過(guò)上調(diào)HO-1的蛋白表達(dá)和酶活性減輕H_2O_2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R965
【圖文】：

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文程發(fā)展中的重要性。臨床研究發(fā)現(xiàn) ARDS 患者呼出氣中可直接檢測(cè)到 H2O2，并且血漿中的脂質(zhì)過(guò)氧化酶也明顯升高。另外 ARDS 患者體內(nèi)抗氧化防御分子包括 SOD、過(guò)氧化氫酶等酶、谷胱甘肽和維生素 E 和維生素 C 等含量隨著 ROS 水平的增加而下降。實(shí)驗(yàn)表明清除多余的 ROS 可以減輕內(nèi)毒素引起的 ALI[10，11]。因此，適當(dāng)?shù)难趸瘎?抗氧化劑平衡對(duì)治療氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肺部血管內(nèi)皮屏障功能障礙至關(guān)重要，所以減少 ROS 的過(guò)量產(chǎn)生和增加抗氧化能力成為治療 ALI/ARDS 的重要途徑。作為機(jī)體免疫反應(yīng)的一部分，巨噬細(xì)胞對(duì)先天免疫和宿主防御至關(guān)重要，肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage,AM是肺組織中數(shù)量最多的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，是肺組織固有免疫系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)和氧化損傷啟動(dòng)的關(guān)鍵因素，因此抑制肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生對(duì)治療由氧化介質(zhì)誘導(dǎo)的 ALARDS 具有重要意義。

圖 1-4MB 化學(xué)結(jié)構(gòu)及氧化還原平衡Figure 1-4 Chemical structure and redox balance of MB加氧酶-1 概述加氧酶（heme oxygenase, HO）酶系是近年的研究熱點(diǎn)，涉及到基礎(chǔ)發(fā)病機(jī)理等研究領(lǐng)域。血紅素加氧酶是血紅素氧化分解代謝的限速酶生一氧化碳（carbon monoxide, CO），游離鐵離子以及膽綠素，膽綠為膽紅素。HO-1 代謝產(chǎn)物 CO、膽紅素、鐵蛋白均具有較強(qiáng)的抗炎、 HO-1 在各種有害因素誘導(dǎo)的急性肺損傷等疾病中有重要保護(hù)作用，抗氧化介質(zhì)[28]。迄今為止，發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共有三種血紅素加氧-1、HO-2 和 HO-3，分別由不同基因編碼, HO- 1 屬于誘導(dǎo)型，廣泛分組織和細(xì)胞中；HO-2 屬于結(jié)構(gòu)型，可大量表達(dá)；HO-3 與 HO-2 結(jié)構(gòu)素降解的效率很低[29]。 的基因調(diào)控 在體內(nèi)大多數(shù)組織內(nèi)呈低水平表達(dá)，在神經(jīng)元、肝臟和脾臟中的表達(dá)但是在體內(nèi)容易被多種的傷害性刺激誘導(dǎo)表達(dá)。HO-1 可被許多生理和

從Keap1解離并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合ARE區(qū)，使得HO-1的表達(dá)增加[35]（圖1-2A）。在大多數(shù)的病理情況下，既有氧化應(yīng)激激活Nrf-2，又有傷害性刺激導(dǎo)致游離血紅素釋放增加，兩者可共同促進(jìn)HO-1的轉(zhuǎn)錄，具有相互協(xié)同的生物學(xué)效應(yīng)[36，37]。研究表明，IL10與HO-1可以相互調(diào)節(jié)。IL-10通過(guò)激活I(lǐng)L-10受體起作用于STAT-3信號(hào)通路，STAT-3轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，隨后誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。HO-1降解血紅素生成CO

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本文編號(hào)：2797810