【摘要】：O-連接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是指將單個(gè)β-N-乙酰葡糖胺連接到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上的一種翻譯后修飾。細(xì)胞O-GlcNAc 水平受兩種關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié):O-GlcNAc transferase(O-GlcNAc 糖基轉(zhuǎn)移酶,OGT)和 O-GlcNAcase(O-GlcNAc 糖苷酶,OGA),分別參與 GlcNAc的添加和去除。細(xì)胞外環(huán)境的變化可導(dǎo)致O-GlcNAc的水平迅速改變,當(dāng)刺激去除后蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化水平恢復(fù)到基線水平。O-GlcNAc穩(wěn)態(tài)的過程對調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能(包括細(xì)胞周期進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)和基因轉(zhuǎn)錄等)至關(guān)重要。體內(nèi)O-GlcNAc糖基化平衡的破壞與多種疾病的發(fā)生有關(guān),如癌癥、心血管疾病和阿爾茨海默病等。在我們的前期研究中使用順鉑(CDDP)、阿霉素(ADM)和長春新堿(VCR)等三種抗腫瘤藥物分別作用于肺癌細(xì)胞H1299、肝癌細(xì)胞HepG2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7,結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平均顯著增高且具有一定的規(guī)律性。因此,本論文研究CDDP誘導(dǎo)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化變化的規(guī)律及其機(jī)制,研究O-GlcNAc糖基化變化對CDDP抗腫瘤活性的影響。由于O-GlcNAc糖基化的程度的改變主要受OGT/OGA和供體UDP-GlcNAc的調(diào)節(jié),因此本論文研究了 CDDP對OGT/OGA活性、蛋白表達(dá)水平和mRNA水平的變化;研究了 CDDP對供體UDP-GlcNAc以及ATP等能量代謝的影響;研究了 CDDP對O-GlcNAc糖基化的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。同時(shí),通過使用抑制劑,在體內(nèi)外研究了蛋白質(zhì)的O-GlcNAc的糖基化程度的變化對CDDP抗腫瘤作用的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中,通過western blotting法檢測三種抗腫瘤藥物CDDP、ADM和VCR對腫瘤細(xì)胞H1299、HepG2和MCF-7糖基化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過藥物作用后細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc糖基化的程度都顯著上升且具有濃度上的依賴性。0、2、8和16 μg/mL等不同濃度的CDDP作用于肺癌細(xì)胞H1299時(shí),OGA、OGT、PFK1、PKM2、GFAT1等相關(guān)蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。HK2、GRP78和CHOP的表達(dá)程度隨著CDDP作用濃度的增高顯著降低并具有濃度的依賴性。RT-qPCR結(jié)果顯示,隨著CDDP作用濃度的上升OGA、OGT的mRNA的水平顯著增長且具有濃度上的依賴性。通過OGA、OGT活性實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),隨著CDDP作用濃度的增加,OGA的活性顯著降低且具有濃度依賴性,而OGT的活性沒有發(fā)生顯著的變化。結(jié)果表明,OGA活性降低是CDDP誘導(dǎo)O-GlcNAc升高的其中的一個(gè)原因�；酋Ａ_丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法測定CDDP單獨(dú)及與OGA的抑制劑TMG/PUGNAc聯(lián)合作用對肺癌細(xì)胞H1299增殖的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CDDP對H1299有顯著的抑制作用且具有濃度上的依賴性;與CDDP單獨(dú)給藥組相比,CDDP與10 μM TMG或100 μM PUGNAc聯(lián)合給藥對肺癌細(xì)胞H1299的增殖抑制作用無顯著性差異。檢測細(xì)胞的凋亡結(jié)果表明,濃度為0、8、16和64 μg/mL的CDDP單獨(dú)給藥時(shí),細(xì)胞凋亡率分別為7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,當(dāng)CDDP與10 μM TMG聯(lián)合給藥時(shí),細(xì)胞的凋亡率分別為9.55%、14.04%、24.65%和44.8%;CDDP與100 μM PUGNAc聯(lián)合給藥時(shí),細(xì)胞的凋亡率分別為16.12%、23.68%、30.07%和50.4%;結(jié)果表明,相較CDDP給藥組,CDDP與TMG或PUGNAc聯(lián)合給藥組沒有顯著地影響細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果表明TMG或PUGNAc所誘導(dǎo)的O-GlcNAc的程度的升高不影響CDDP對細(xì)胞的增殖抑制,也沒改變CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。SRB法檢測CDDP獨(dú)自及與OGT抑制劑Alloxan聯(lián)合作用對細(xì)胞H1299增殖抑制的影響,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與CDDP單獨(dú)給藥組相比,CDDP與10 mM Alloxan聯(lián)合給藥對細(xì)胞的增殖抑制沒有顯著變化;細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,0、8、16和64μg/mLCDDP單獨(dú)給藥H1299細(xì)胞時(shí)的凋亡率為7.48%、13.88%、26.97%和53.06%,CDDP與10 mM Alloxan聯(lián)合給藥時(shí)細(xì)胞的凋亡率分別為19.53%、34.26%、55.02%和74.67%。聯(lián)合給藥的細(xì)胞凋亡率明顯比CDDP給藥組高,結(jié)果表明,OGT抑制劑Alloxan降低蛋白質(zhì)O-GlcNAc的水平后并不影響CDDP對細(xì)胞的增殖抑制。在研究CDDP誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的程度與細(xì)胞內(nèi)UDP-GlcNAc含量的關(guān)系時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞H1299中,隨著CDDP作用濃度的增加細(xì)胞內(nèi)的 UDP-GlcNAc 含量從 1.9 mmol/1011cells 上升至 4.34 mmol/1011cells 且具有濃度依賴性;隨著CDDP作用時(shí)間的增加,UDP-GlcNAc含量從0.65 mmol/1011 cells上升至4.34 mmol/1011cells且具有時(shí)間依賴性。當(dāng)用GFAT1的抑制劑DON作用于肺癌細(xì)胞時(shí),隨著DON濃度的升高,細(xì)胞內(nèi)的UDP-GlcNAc含量從1.77 mmol/1011cells下降至0.88 mmol/1011cells且具有濃度依賴性;而在DON為40μM時(shí),隨著DON作用的時(shí)間的增加,其內(nèi)的UDP-GlcNAc含量從0 h的1.33 mmol/1011cells下降至作用48 h的0.61 mmol/1011cells且具有時(shí)間依賴性。相比CDDP給藥,CDDP與DON聯(lián)合給藥組的蛋白質(zhì)O-GlcNAc的程度降低且具有濃度的依賴性。western blotting法測定CDDP與葡萄糖/谷氨酰胺聯(lián)合給藥對O-GlcNAc糖基化程度的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于CDDP給藥組,聯(lián)合給藥組中O-GlcNAc糖基化的程度顯著增高。上述的實(shí)驗(yàn)表明,UDP-GlcNAc濃度與CDDP誘導(dǎo)的O-GlcNAc程度的升高有關(guān)。通過相關(guān)試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的CDDP作用于肺癌細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)的ATP含量從0.33 mmol/104cells上升至0.73 mmol/104cells,細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的含量從2.43 μmol/109cells上升至4.83 μmol/109cells、細(xì)胞內(nèi)丙酮酸的含量從1.6μg/107cells上升至3.8 μg/107cells且均具有濃度依賴性。能量代謝與CDDP誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化升高之間的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。我們通過質(zhì)譜分析進(jìn)一步檢測了 CDDP誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化及糖基化變化的程度,結(jié)果顯示,使用O-GlcNAc抗體通過免疫沉淀技術(shù)富集糖基化的蛋白質(zhì),質(zhì)譜分析結(jié)果表明,部分蛋白質(zhì)只在對照組表達(dá),部分蛋白質(zhì)只在CDDP給藥組表達(dá),有些蛋白在兩組均表達(dá)但表達(dá)水平有差異。在裸鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們選用了 PBS組、4 mg/kg CDDP組、8 mg/kg CDDP組、1 rmg/kg PUGNAc 組及 4 mg/kg CDDP 和 1 mg/kg PUGNAc 聯(lián)合給藥組進(jìn)行試驗(yàn),通過對裸鼠的瘤塊體積進(jìn)行測定,計(jì)算出這四組的抑瘤率分別為13%、83%、5%和14%。通過western blotting法檢測腫瘤組織、肺組織和肝臟組織中蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化的程度及OGA、OGT的表達(dá)程度發(fā)現(xiàn),在4 mg/kg和8 mg/kg CDDP劑量下,三個(gè)組織中的蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的程度及OGT的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯的變化,OGA在腫瘤組織中的表達(dá)量隨著CDDP濃度的增加顯著升高且具有劑量的依賴性;而PUGNAc單獨(dú)給藥組在肝臟組織和腫瘤組織中的O-GlcNAc糖基化的程度顯著上升。結(jié)果表明,CDDP沒有改變裸鼠腫瘤組織的O-GlcNAc糖基化的程度,OGA的抑制劑PUGNAc可以升高腫瘤組織的O-GlcNAc糖基化的程度,但PUGNAc單獨(dú)對腫瘤的生長沒有明顯的抑制作用,PUGNAc與CDDP聯(lián)合使用也沒有改變CDDP對腫瘤生長的抑制作用。綜上所述,本研究得出如下結(jié)論:CDDP誘導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化程度的升高主要由OGA的活性下降以及UDP-GlcNAc濃度升高引起的;升高或者降低O-GlcNAc糖基化的程度沒有改變CDDP對細(xì)胞增殖抑制,也不能影響CDDP對荷瘤的裸鼠腫瘤生長的抑制。本研究在蛋白質(zhì)糖基化方向?yàn)榻鉀QCDDP耐藥、提高腫瘤細(xì)胞對CDDP的藥物敏感性進(jìn)行了探索,為研究糖基化與藥效關(guān)系奠定了良好基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R96
【圖文】：

選用８邋（ｉｇ／ｍＬ的ＣＤＤＰ作用肺癌細(xì)胞Ｈ１２９９，作用時(shí)間分別為０、３邋ｈ、６邋ｈ、逡逑］２邋ｈ、２４邋ｈ、４８邋ｈ邋和邋７２邋ｈ，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋對蛋白質(zhì)的邋Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ邋水平與邋ＣＤＤＰ逡逑作用時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行檢測。如圖２－２所示，相比對照組，在２４邋ｈ之前，隨著ＣＤＤＰ逡逑作用時(shí)間的X椉櫻埃牽藎悖危粒閭腔潭認(rèn)災(zāi)仙頁適奔淶囊覽敵�；２４邋ｈ之后，辶x纖孀牛茫模模兇饔檬奔淶腦雋�，蛋白的Ｏ－繗e悖危粒闥嬌冀檔�，ＡP插澹枋保希牽歟悖危粒沐義纖餃愿哂諼錘┳櫚畝哉障赴�。实验结果钡a鰨孀牛茫模模兇饔玫氖奔湓黽櫻義希齲保玻梗瓜赴詰牡鞍字剩希牽歟悖危粒闥講歡仙擼弊饔檬奔渥愎懷�，细胞内辶x系姆蠢』品⒒幼饔�，蕼厦细胞脑懩蛋白质Ｏ－繗e悖危粒閭腔潭然毓檎Ｋ�。辶x希茫模模繡澹稿澹椋玨澹恚戾義希板危沖危跺危保插澹玻村澹矗稿澹罰插澹楨義稀Υ纜跺義希俊恚�？逦ｍｕｍｍ邋４＿b停繡澹恚恚礤澹擼擼擼擼咤義希希牽歟悖危粒沐義希穡幔悖簦椋鑠危恚礤澹恚恚礤澹恚礤澹恚礤澹恚礤澹恚礤義賢跡玻插澹茫模模脅煌饔檬奔潿韻赴齲保玻梗溝鞍字剩希牽歟悖危粒閭腔撓跋戾義希疲椋紓澹玻插澹祝澹螅簦澹潁鑠澹猓歟錚簦簦椋睿玨澹幔睿幔歟螅椋簀澹錚駑澹簦瑁邋澹澹穡潁澹螅螅椋錚鑠澹錚駑澹穡潁錚簦澹椋鑠澹希牽歟悖危粒悖歟幔簦椋錚鑠澹椋鑠義希歟酰睿玨澹悖幔睿悖澹蟈澹悖澹歟歟簀澹齲保玻梗瑰義銜搜芯浚茫模模卸韻赴齲保玻梗溝鞍字剩希牽歟悖危粒閭腔撓跋旎

本文編號：2796174