【摘要】：為了篩選具有抗腫瘤活性的微生物發(fā)酵產(chǎn)物,本課題選擇了瑞士乳桿菌和四種食藥用真菌的發(fā)酵產(chǎn)物,以結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為體外研究模型,來研究發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。本論文的第一部分主要研究了瑞士乳桿菌胞外多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移的影響。當(dāng)胞外多糖處理時(shí)間為12h、24h時(shí),隨著濃度的增加,結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的存活率無明顯變化,當(dāng)胞外多糖處理48h,1mg/mL的處理濃度下,結(jié)腸癌細(xì)胞SW480存活率發(fā)生顯著降低,為對(duì)照組的80.5%。并且隨著胞外多糖處理濃度的增加,結(jié)腸癌細(xì)胞SW480存活率降低越來越明顯,處理48h后,10mg/mL的處理濃度下存活率降低為對(duì)照組的33.5%。這表明瑞士乳桿菌胞外多糖能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖,并呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。為了進(jìn)一步研究了瑞士乳桿菌胞外多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的抑制作用是否的通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的,我們檢測(cè)了經(jīng)5mg/mL和10mg/mL胞外多糖處理48h后SW480細(xì)胞凋亡率的變化,結(jié)果表明經(jīng)5mg/mL、10mg/mL的胞外多糖處理后,SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比沒有顯著變化,表明胞外多糖抑制SW480細(xì)胞增殖不是通過誘導(dǎo)凋亡實(shí)現(xiàn)。接著我們又研究了胞外多糖處理對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比用2.5mg/mL和5mg/mL胞外多糖處理的SW480細(xì)胞遷移能力顯著降低。以上研究表明胞外多糖能夠抑制SW480細(xì)胞增殖、遷移,但未能引起SW480細(xì)胞凋亡。本論文第二部分主要研究了靈芝真菌、平菇真菌、乳白耙菌、裂褶菌四種真菌用土豆培養(yǎng)基,以及在土豆培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加了2%枳實(shí)、2%玉米秸稈、2%紅薯渣基質(zhì)培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物,對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖及細(xì)胞凋亡的影響。首先通過CCK8實(shí)驗(yàn)初步研究了四種真菌的不同發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響,發(fā)現(xiàn)四種真菌中裂褶菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性最強(qiáng);而在土豆培養(yǎng)基中添加的三種不同基質(zhì)中,添加玉米秸稈基質(zhì)能有效增強(qiáng)不同真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性。因此,我們挑選添加玉米秸稈基質(zhì)的裂褶菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步研究其降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480存活率的機(jī)制。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)該發(fā)酵產(chǎn)物處理的SW480細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的含量顯著增加,并且蛋白免疫印記結(jié)果顯示經(jīng)該發(fā)酵產(chǎn)物處理的SW480細(xì)胞中Caspase3、PARP蛋白被切割,進(jìn)一步證實(shí)了該發(fā)酵產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。接下來為確定該發(fā)酵產(chǎn)物誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡的具體途徑,我們檢測(cè)了該發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)SW480細(xì)胞線粒體膜電位的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)該發(fā)酵產(chǎn)物處理后SW480細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低,同時(shí)活性氧水平顯著提高,表明該發(fā)酵產(chǎn)物可能通過激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了瑞士乳桿菌胞外多糖能降低結(jié)腸癌細(xì)胞SW480存活率并抑制其遷移但未能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;四種真菌發(fā)酵產(chǎn)物中,裂褶菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性最強(qiáng);而三種不同基質(zhì)中,添加玉米秸稈基質(zhì)能有效增強(qiáng)不同真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性。且研究發(fā)現(xiàn)添加玉米秸稈基質(zhì)的裂褶菌發(fā)酵產(chǎn)物能夠降低SW480細(xì)胞線粒體膜電位,并且提高SW480細(xì)胞活性氧的水平,表明其可通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480凋亡。本研究初步篩選出來具有抗結(jié)腸癌細(xì)胞SW480活性的發(fā)酵產(chǎn)物,為后續(xù)進(jìn)一步研究該發(fā)酵產(chǎn)物并從中分離出良好的抗腫瘤活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R965.1
【圖文】：

CCK8 法測(cè)定瑞士乳桿菌胞外多糖處理 12、24、48h 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 存活率度的胞外多糖處理結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 12h、24h、48h 后細(xì)胞的存活率。讀取加入 CC值。各時(shí)刻 0mg/mL 處理組的吸光值標(biāo)準(zhǔn)化為 100%。數(shù)據(jù)表示為 mean±SD，n=差異 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ，***：P<0.001 ，****：P<0.0001。瑞士乳桿菌胞外多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 凋亡的影響越來越多的研究表明，許多植物多糖、真菌多糖等多糖類物質(zhì)是通過誘導(dǎo)亡來發(fā)揮它抑制腫瘤功能的。那么瑞士乳桿菌胞外多糖是否也是通過誘導(dǎo)來抑制細(xì)胞存活率，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤功效呢？為檢測(cè)瑞士乳桿菌胞外多糖能否誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，在本文中采用熒光xin V-FITC 和熒光染料 PI 雙染細(xì)胞的方式，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞是亡。結(jié)果如圖 3.2 所示，其中左上象限表示壞死細(xì)胞所在的區(qū)域，右上象限凋亡細(xì)胞所在的區(qū)域，左下象限表示活細(xì)胞所在的區(qū)域，右下象限表示的

SW480 中發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例沒有發(fā)生顯著改變，胞 SW480 凋亡無影響。胞外多糖降低結(jié)腸癌細(xì)胞胞凋亡介導(dǎo)，有可能通過影響細(xì)胞周期來起作用，等來實(shí)現(xiàn)，具體的作用方式需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研ntrol 組 5mg/mL 處理組 10mg/mL7.6%1.3%7.8%1.7%Annexin-FITC

21 不同濃度的瑞士乳桿菌胞外多糖處理結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 遷移能力的影響（100μ/mL 胞外多糖處理組 、2.5mg/mL 胞外多糖處理組 、5mg/mL 胞外多糖處理組 80 劃痕區(qū)域面積。B：瑞士乳桿菌胞外多糖對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞 SW480 劃痕區(qū)域面積析。以 0h 細(xì)胞的劃痕面積為 100%，量化之后時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積。數(shù)據(jù)表示為 m

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