【摘要】：目的:本課題展開研究廣西眼鏡蛇毒液生長(zhǎng)因子(NGF)通過調(diào)控自噬誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化的作用,為進(jìn)一步探討NGF誘導(dǎo)干細(xì)胞軟骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)支持。方法:實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:第一部分分組(1)空白對(duì)照組、(2)NGF組、(3)TGF-β組。NGF在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞3天、5天、7天后進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè):(1)細(xì)胞的生存情況檢測(cè):FDA/PI染色、DNA含量檢測(cè);(2)軟骨分化指標(biāo)檢測(cè):番紅O染色、HE染色、糖胺聚糖(GAG)的含量檢測(cè)、免疫熒光(一型膠原、二型膠原)、RT-PCR檢驗(yàn)COL1A1、COL2A1、SOX9、ACAN表達(dá)量。第二部分分組(1)空白對(duì)照組、(2)NGF組、(3)TGF-β組、(4)Control+Ra(雷帕霉素)。體外誘導(dǎo)干細(xì)胞3天、5天、7天后進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè):(1)Stub-RFP-Sens-GFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染監(jiān)控自噬流;(2)透射電鏡(TEM);(3)Western Blot檢測(cè)LC3I/II、ATG5、ATG7、BECN-1、P62含量。第三部分通過基因芯片技術(shù),篩選出與自噬相關(guān)的基因,具體實(shí)驗(yàn)如下:在通過RNA測(cè)序后,從大批量的數(shù)據(jù)中找出具有顯著性差異表達(dá)的的基因,然后對(duì)差異基因使用生物信息學(xué)手段分析。然后通過RT-PCR驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá),查閱相關(guān)的文獻(xiàn),選出具有潛在意義和創(chuàng)新性的基因作為本課題的基因。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染手段使沉默目的基因。轉(zhuǎn)染的效率通過觀察熒光的強(qiáng)弱和RT-PCR在基因水平上驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染成功后,培養(yǎng)正常的干細(xì)胞和基因沉默的干細(xì)胞,通過DNA含量的測(cè)定,FDA/PI染色、HE染色、GAG的含量檢測(cè)、免疫熒光染色、RT-PCR、Stub-RFP-Sens-GFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染、透射電鏡(TEM)、Western Blot等方法進(jìn)一步的觀察目的基因?qū)GF誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化過程的影響。結(jié)果:通過考察NGF在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化,結(jié)果如下:(1)FDA/PI染色、DNA含量檢測(cè)顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加細(xì)胞數(shù)量越來越多;(2)通過檢測(cè)軟骨分化標(biāo)志:番紅O、HE、GAG的含量、免疫熒光(一型膠原、二型膠原)、RT-PCR(COL1A1、COL2A1、SOX9、ACAN),結(jié)果表明在NGF組和TGF-β組中出現(xiàn)了軟骨細(xì)胞特異性特征,能夠分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(糖胺聚糖和硫酸軟骨素等),同時(shí)軟骨特異性基因COL2A1、SOX9、ACAN明顯上調(diào);(3)通過自噬相關(guān)檢測(cè):RFP-GFP-LC3雙熒光慢病毒檢測(cè);TEM結(jié)果表明在NGF組中比對(duì)照組相比可看到更多的自噬小體,Western Blot(LC3I/II、ATG5、ATG7、BECN-1、P62)結(jié)果顯示NGF可以明顯上調(diào)自噬關(guān)鍵蛋白。通過基因芯片技術(shù),一些生物信息學(xué)手段對(duì)差異基因表達(dá)進(jìn)行火山圖分析、KEGG Pathway功能富集,篩選與自噬相關(guān)的基因進(jìn)行熱火圖的分析,并繪制KEGG Pathway通路圖、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖更加直觀了解與自噬有關(guān)的差異基因和干細(xì)胞分化的關(guān)聯(lián)。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,在NGF組中檢測(cè)到了自噬相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào),說明干細(xì)胞在分化為軟骨的過程中有自噬的發(fā)生。篩選出目的基因進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,在培養(yǎng)8天后,綠色熒光表達(dá)明顯。目的基因的表達(dá)通過RT-PCR檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在正常組中目的基因的的表達(dá)水平明顯高于基因沉默組(P0.05),表明基因沉默成功。在體外考察廣西眼鏡蛇毒液NGF誘導(dǎo)干細(xì)胞軟骨分化的過程中,培養(yǎng)正常干細(xì)胞和基因沉默細(xì)胞在7天時(shí),正常的干細(xì)胞在NGF誘導(dǎo)液的作用下軟骨相關(guān)基因COL2A1、SOX9、ACAN的表達(dá)與基因沉默組相比具有明顯差異(P0.05)。同時(shí)DNA的含量測(cè)定、HE染色、FDA/PI染色、GAG含量測(cè)定等進(jìn)一步證實(shí)了RT-PCR的結(jié)果。而在自噬相關(guān)檢測(cè)中NGF組的自噬表達(dá)水平明顯高于基因沉默組。結(jié)論:通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明廣西眼鏡蛇毒液NGF能夠在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化�；诨蛐酒夹g(shù),篩選出的目的基因,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沉默,進(jìn)一步證實(shí)了NGF在體外通過調(diào)控自噬誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化中發(fā)揮了一定作用,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為探討NGF誘導(dǎo)干細(xì)胞成軟骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),將更好的應(yīng)用在軟骨修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R96
【圖文】：

蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控自噬誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用及其機(jī)制研究 2018屆碩士學(xué)位論文2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1 MTT 法檢測(cè)眼鏡蛇毒 NGF 對(duì) BMSCs 的增殖活性采用 MTT 試驗(yàn)測(cè)定 NGF 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性，不同濃度的 NGF 分別作用于干細(xì)胞，于 3d 后進(jìn)行 MTT 試驗(yàn)檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NGF（圖 1-1）在濃度為 6μg/mL 其對(duì)應(yīng)的 OD 值最大,對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖作用最強(qiáng)。

蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控自噬誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用及其機(jī)制研究 2018屆碩士學(xué)位論文2.2 HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)圖 1-2 為干細(xì)胞 HE 染色結(jié)果，藍(lán)色為細(xì)胞核為蘇木素所染；紅色為細(xì)胞外基質(zhì)為伊紅所染。在 NGF 組與 TGF-β組中可以看見到典型的圓形或者橢圓狀的細(xì)胞形狀，還有明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，這與軟骨細(xì)胞形態(tài)特征相似。而在空白對(duì)照組中沒發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞數(shù)量明顯少于其他組。各組隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，在培養(yǎng) 7 天后，NGF 組中可觀察到有明顯的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞數(shù)量也顯著增多。

蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控自噬誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用及其機(jī)制研究 2018屆碩士學(xué)位論文2.3 FDA/PI 染色觀察細(xì)胞活性檢測(cè)各組活細(xì)胞和死細(xì)胞熒光染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果見圖 1-3隨著培養(yǎng)時(shí)間 3 天，5 天，7 天的增加，各組中綠色熒光強(qiáng)度都逐漸的增加，同時(shí)綠色熒光面積各組也都在逐漸增加，反映了各組的細(xì)胞都呈上升趨勢(shì)。TGF-β組的活細(xì)胞數(shù)量?jī)?yōu)于或相近 NGF 組，NGF 組的活細(xì)胞數(shù)量多于 Control 組。這表明 NGF 能更好的支持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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本文編號(hào)：2790862