發(fā)布時間：2020-08-09 16:14

【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是廣泛分布于細胞表面的七次跨膜蛋白,它由胞外區(qū)(Extracellular domain,ECD)、跨膜區(qū)(Transmembrane domain,TMD)和胞內區(qū)組成。其中ECD主要和配體的識別與結合相關,配體與受體結合后可引起第六個跨膜螺旋(The 6~thh transmembrane helix,TM6)等的扭轉和外移,從而為下游G蛋白提供結合空間。GPCRs可通過G蛋白和Arrestin等效應蛋白進行信號轉導。B類GPCRs是體內多種激素的受體,相比于其他GPCRs家族,B類受體有一個較大的胞外區(qū)。這一特點使得B類GPCRs較難表達純化,因此加大了該家族受體結構解析的難度。作為重要的藥物靶點,B類GPCRs可以調控包括糖尿病、肥胖、骨質疏松和心血管疾病在內的多種疾病。本論文的主要研究對象1型甲狀旁腺激素受體(The parathyroid hormone receptor-1,PTH1R)和2型甲狀旁腺激素受體(The parathyroid hormone receptor-2,PTH2R)都屬于B類GPCRs。前者主要調控機體的鈣穩(wěn)態(tài)和骨代謝,其功能異�？梢鸸琴|疏松等疾病。后者主要在中樞神經表達,可調控情緒、體溫、細胞增殖和心血管功能等。盡管兩者在維持機體正常的生理功能中扮演著重要角色,但由于缺乏結構信息,開發(fā)靶向這兩個受體的藥物仍面臨很大的挑戰(zhàn)。本論文期望通過解析激活狀態(tài)下的甲狀旁腺激素受體與配體、Gs蛋白形成的復合物結構,闡明三者間相互作用的機制,為靶向藥物開發(fā)提供指導。PTH1R復合物結構解析與藥物作用位點研究中,我們對受體克隆、融合標簽和表達系統(tǒng)進行了篩選,然后將Gs蛋白單獨純化并在受體純化時外源加入Gs蛋白獲得了復合物,但該復合物不穩(wěn)定無法進行冷凍電鏡收樣。后來我們嘗試將受體與Gs蛋白在Sf9昆蟲細胞中共表達,然后加入長效激活甲狀旁腺激素(Long-acting PTH,LA-PTH)進行純化。共表達的蛋白可形成穩(wěn)定的復合物,在冷凍電鏡收樣和數(shù)據(jù)處理分析后,我們獲得了分辨率為3?的處于激活狀態(tài)的LA-PTH-PTH1R-Gs復合物。該結構是首個配體-PTH1R-G蛋白復合物的結構,為研究配體與受體和受體與G蛋白間的相互作用機制提供了詳細的結構信息,也為基于PTH1R結構的藥物研發(fā)創(chuàng)造了新的機遇。在PTH2R的結構解析與藥物作用位點研究中,我們通過篩選不同融合標簽、受體C端截短和W突變等獲得了穩(wěn)定表達的受體蛋白。將受體與Gs蛋白共表達,并外源加入配體進行復合物純化。目前,我們已經可以拿到配體-受體-Gs蛋白三聚體復合物,但該復合物還不夠穩(wěn)定,需要進一步優(yōu)化。雖然配體-PTH2R-Gs蛋白復合物結構目前還未得到解析,但前期的篩選優(yōu)化為后續(xù)的結構解析提供了基礎,也可為其他GPCRs的表達純化提供參考。除了對甲狀旁腺激素受體的結構研究以外,本論文還包括對甲硫氨酰tRNA合成酶(Methionyl-tRNA synthetase,MRS)抑制劑的高通量篩選(High throughput screening,HTS)實驗。該實驗中我們建立了以Nano-BiT為基礎的篩選模型,然后對國家化合物樣品庫中96000個隨機選取的小分子化合物進行篩選。經過初篩、復篩、特異性實驗、毒性實驗和細胞增殖實驗,我們最終篩選出兩個IC_(50)在幾十μM、毒性較小,且在細胞增殖實驗中表現(xiàn)出明顯的細胞增殖抑制作用的化合物WNN1588-A010和WNN1588-B003,為后期的功能研究和藥物開發(fā)打下基礎。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院上海藥物研究所)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 1.1 經典的 G 蛋白信號轉導通路示意圖re1.1 Classic G protein signal transduction pathway schematic diagramPCRs GPCRs 概況PCRs 對機體激素平衡起著關鍵的調控作用，是一類非常重要的其的藥物可用于治療糖尿病、肥胖、精神疾病和骨疾等[25]。其成員（Calcitoninreceptor，CTR）和甲狀旁腺激素受體（ParathyroidhorTHR）可調控骨更新和鈣平衡，靶向這兩者的藥物可用于骨質疏胰島素釋放和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的胰高血糖素樣受體 1（GlucagoGLP-1） 和葡萄糖依賴的促胰島素釋放肽（ Glucose-depe

圖 1.2 B 類 GPCR 各亞家族及其成員igure1.2 Class B GPCR subfamilies and members of each one GPCRs 由降鈣素受體家族、胰高血糖素受體家族、血管活性聚上腺皮質釋放因子受體家族和甲狀旁腺激素受體家族五個亞庫 GPCR database 下載（https://gpcrdb.org/structure/statistics）。lass B GPCRs include five subfamilies which are calcitonin peptidticotropin-releasing factor receptors, glucagon receptors, vasoactivnd parathyroid hormone receptors.

hCTR-sCT-Gs[33]rGLP-1R-GLP1-Gs[37]hGLP-1R-ExP5-Gs[35]RAMP1-CLR-CGRP[36]圖 1.3 部分已解析的 GPCRs 全長結構Figure1.3 Part of resolved GPCRs full-length structuresB 類 GPCRs 的 ECD 序列保守度較低，只有形成 3 對二硫鍵的 6 個半胱氨酸和其他十個左右的保守氨基酸。這些氨基酸中有 4 個氨基酸（在 PTH1R 中編碼為 D113，W118，P132 和 W154）是完全保守的。雖然 ECD 的序列保守性差，但所有的 B 類受體胞外區(qū)的基本結構都是一個由三個層間二硫鍵固定的三層的α-β-β-α 折疊，且多肽激活都遵循“雙域模型”。[38]ECD 對于多肽配體與受體結合的高親和性和特異性是必不可少的，目前被解析的 ECD 結構大部分是與配體結合的復合物，這表明配體的結合可以穩(wěn)定受體的 ECD[29, 30, 38]。TMD 的主要功能是通過構像改變介導受體激活，同時向 G 蛋白傳導信號。

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