發(fā)布時(shí)間：2020-08-07 21:30

【摘要】：目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是嗜肝性DNA病毒,HBV感染可引起急性或慢性的病毒性肝炎,從而可發(fā)生肝臟的纖維化、肝硬化甚至是肝細(xì)胞癌癥。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗HBV的藥物主要有免疫調(diào)節(jié)劑和核苷類似物。抑制病毒是目前治療慢性乙型肝炎的重要手段,其中占首位的藥物有干擾素類和核苷(酸)類似物(NAs)。干擾素可以通過抗病毒、免疫調(diào)控的機(jī)理治療慢性肝炎(CHB)。它具有持續(xù)反應(yīng)率高、療效穩(wěn)定、治療過程相對(duì)穩(wěn)定、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。但是干擾素治療效果很一般,初期常伴有一定時(shí)期的流感樣癥狀,能引發(fā)骨髓抑制、肝臟損害等不良反應(yīng),對(duì)于肝功能近于失代償或已經(jīng)發(fā)生的患者會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。另外干擾素使用不便,通常為皮下注射,且對(duì)于免疫功能不全的患者不適用。因此,干擾素的臨床應(yīng)用受到很大限制。核苷類似物口服給藥方便生物利用度高、抗病毒作用較強(qiáng),不依賴患者對(duì)HBV的免疫反應(yīng),故而不良反應(yīng)少而比較輕,可用于肝功能失代償者,因此在臨床上應(yīng)用廣泛,但核苷類似物不能徹底清除體內(nèi)病毒,需要持久應(yīng)用,容易發(fā)生耐藥性。本課題旨在研究10種中藥化合物體外抗乙肝病毒活性及其作用機(jī)制,為尋找新型抗乙肝病毒藥物奠定基礎(chǔ)。方法:本課題采用HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞為模型選出10種化合物體外抑制HBV作用及對(duì)HBV X基因相關(guān)機(jī)制的初步探討,實(shí)驗(yàn)分為兩部分,內(nèi)容如下:第一部分10種化合物抗HBV作用的體外篩選(1)藥物的細(xì)胞毒性檢測(cè):HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)3天,第三天MTT法檢測(cè)化合物對(duì)于細(xì)胞的毒性。(2)藥物對(duì)HBV e抗原和s抗原抑制的檢測(cè):HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集6天的上清液,用ELISA方法檢測(cè)樣品對(duì)HBV s抗原和e抗原的表達(dá)量。(3)藥物對(duì)HBV病毒DNA抑制檢測(cè):HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)后,加入所配不同濃度含藥培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集上清液和細(xì)胞,用FQ-PCR法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA的影響。第二部分10種化合物抗HBV X基因相關(guān)機(jī)制的初步研究RT-PCR法檢測(cè)化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞HBV X基因表達(dá)水平。HepG2.2.15和HepGRL1細(xì)胞在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24小時(shí)后,加入所配不同濃度含化合物的培養(yǎng)液,陽(yáng)性對(duì)照組用3-TC和ETV,空白組只加入培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)6天(每3天換液一次),收集細(xì)胞提取RNA并反轉(zhuǎn),用RT-PCR法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV X基因表達(dá)的影響。結(jié)果:第一部分10種化合物抗HBV作用的體外篩選(1)10種不同的化合物分別作用HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞,MTT法分別測(cè)出化合物對(duì)于兩種細(xì)胞的毒性計(jì)算出TC_(50)。(2)Elisa法檢測(cè)化合物對(duì)于兩種細(xì)胞的HBV e抗原和s抗原表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn),yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV e抗原和s抗原具有較強(qiáng)的抑制作用,另外yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a、yxy1403b對(duì)HepGRL1細(xì)胞的HBV e抗原具有較強(qiáng)的抑制作用。(3)用Q-PCR法檢測(cè)10種化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)HBV DNA分泌的影響,發(fā)現(xiàn)yxy1741、yxy1483e、yxy1483c顯著性抑制HBV DNA復(fù)制,并且與空白組相比,抑制率超過50%,且該化合物顯著性抑制HBeAg、HBsAg水平。第二部分10種化合物抗HBV X基因相關(guān)機(jī)制的初步研究RT-PCR結(jié)果顯示yxy1483e不但對(duì)兩種細(xì)胞HBV e抗原和HBV s抗原和HBV DNA有一定抑制作用,而且能抑制細(xì)胞中HBV-X RNA的表達(dá)。結(jié)論:通過本研究表明,在HepG2.2.15細(xì)胞和HepGRL1細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,yxy1483e能明顯抑制體外HBV DNA復(fù)制,同時(shí)能對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)也有較強(qiáng)的抑制作用,且細(xì)胞毒性較小,對(duì)HBV-X RNA的表達(dá)有抑制作用,將有可能發(fā)展為新一種的抗HBV的藥物。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R965.1
【圖文】：

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b對(duì)野生型HBV細(xì)胞株HepG2.2.15作用6天的抑制的率

yxy1741、yxy1483e、yxy1483c、yxy1452a和yxy1403b對(duì)拉米夫定耐藥HBV細(xì)胞株HepGRL1HBeAg的抑制作用（與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，□P<0.05，□□P<0.01）

幾種化合物對(duì)HBV細(xì)胞株Hep2.2.15HBV-X基因表達(dá)的影響

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2784552