【摘要】：目的:1、制備可用于時間分辨熒光免疫分析技術的熒光納米粒。2、通過比較不同濃度吐溫80溶液對RBL-2H3、P815、Ku812細胞脫顆粒的影響,篩選出一套靈敏、穩(wěn)定的體外肥大細胞脫顆粒模型,并以篩選出的細胞模型探討注射用益氣復脈(凍干)類過敏反應。方法:1、以稀土元素銪與4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮合成的稀土配合物作為發(fā)光物質,以苯乙烯為聚合單體,通過乳液聚合法和分散聚合法分別制備時間分辨熒光納米粒,通過馬爾文粒徑電位分析儀監(jiān)測納米粒的粒徑及分散性,以紫外燈、熒光分光光度計分別檢測納米粒的顯色情況和熒光強度。2、體外培養(yǎng)RBL-2H3、P815和Ku812細胞,測定三株細胞的生長曲線,在細胞生長對數(shù)期,以不同濃度(0.04、0.2、1、5、10、20、40、80 mg/ml)吐溫80分別刺激三株細胞,采用中性紅染色法顯微鏡下觀察不同濃度吐溫80溶液對三株細胞脫顆粒的影響,并計算脫顆粒百分率,同時以化學發(fā)光法、比色法分別檢測組胺和β-氨基己糖苷酶釋放率,以酶聯(lián)免疫吸附法測定類胰蛋白酶的釋放量;通過對比三株細胞系細胞脫顆粒指標的差異性,優(yōu)選出一套最適合的細胞系作為體外肥大細胞脫顆粒的檢測模型,以此考察注射用益氣復脈(凍干)類過敏反應;并進一步檢測吐溫80和注射用益氣復脈(凍干)對人的肥大細胞IgE釋放的影響。結果:1、稀土元素銪與4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮合成的稀土配合物Eu(NTA)_3在紫外燈下顯耀眼的紅色,為Eu~(3+)的特征顏色,在熒光分光光度計上分析,熒光光譜表現(xiàn)出Eu~(3+)的特征峰;乳液聚合法制備的納米粒粒徑均一、可控,分散性較好(PDI0.1),但是在紫外燈下不顯色;分散聚合法制備的納米粒在紫外燈下顯紅色,激發(fā)光譜表現(xiàn)出Eu~(3+)的特征峰,但是分散性較差,經過反應優(yōu)化(在反應時加入適量的交聯(lián)劑),粒徑分散性變好。2、三株肥大細胞脫顆粒模型中,各細胞的脫顆粒百分率、組胺釋放率、β-氨基己糖苷酶的釋放率和類胰蛋白酶釋放量均隨吐溫80溶液濃度的增大而增多,在相同刺激條件下,Ku812細胞脫顆粒最靈敏,但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)Ku812細胞模型穩(wěn)定性、可重復性較差,而RBL-2H3細胞的靈敏度雖次于Ku812細胞,但其穩(wěn)定性、可重復性均優(yōu)于Ku812和P815細胞。以RBL-2H3細胞考察注射用益氣復脈(凍干)類過敏反應,注射用益氣復脈(凍干)會引起細胞脫顆�，F(xiàn)象,且脫顆粒程度與濃度呈依賴性;臨床等效濃度的注射用益氣復脈(凍干)和紅參、麥冬、五味子提取物對比,紅參、麥冬、五味子提取物脫顆粒指標程度均不高于等效濃度的注射用益氣復脈(凍干),但在三種主要成分中麥冬的脫顆粒程度較高,較接近注射用益氣復脈(凍干)脫顆粒程度。另外,0.04-80 mg/ml的吐溫80溶液以及臨床給藥濃度范圍的注射用益氣復脈(凍干)作用于Ku812細胞產生的IgE量均低于檢測限。結論:1、本研究證明了4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮作為稀土元素銪的配體,能夠有效地向中心離子Eu~(3+)傳遞能量,產生較強的熒光;乳液聚合法不適合制備時間分辨熒光納米粒;分散聚合法適用于制備時間分辨熒光納米粒,但在反應中需要加入交聯(lián)劑,且交聯(lián)劑的加入量對反應體系的分散性影響較大,這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)相關研究奠定基礎。2、本文進一步確定吐溫80、注射用益氣復脈(凍干)誘導的過敏反應是不經過IgE介導的類過敏反應,隨著吐溫80濃度的增大,三個細胞模型脫顆�，F(xiàn)象顯著,但相比于Ku812和P815細胞,RBL-2H3細胞更適合作為體外肥大細胞脫顆粒檢測模型。注射用益氣復脈(凍干)會引起類過敏反應,其主要成分紅參、麥冬、五味子提取物均會引起類過敏反應,且發(fā)現(xiàn)麥冬是引起類過敏反應比較主要的成分,為注射用益氣復脈(凍干)的生產研究部門提供一定的理論指導。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

天津醫(yī)科大學碩士學位論文續(xù)表 1.40.21 150.73 1.37 00.28 134.93 0.61 00.33 119.23 0.93 00.39 90.90 0.78 00.50 78.43 1.01 0驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，乳液聚合法適合制備 400nm 及其備的納米粒分散性較好（PDI<0.1）；在實驗中，隨著 SDS 濃度的增大，納米粒粒徑逐漸減小色分析

天津醫(yī)科大學碩士學位論文趨勢，這是由于單體用量的增加，反應體系粘稠度增加，反應體系的分散介質對聚合物鏈的溶解性增加，導致低聚物臨界鏈增長，使成核階段形成的聚合物粒子數(shù)目減少，核上生長的單體增多，使納米粒最終粒徑增大［48］。（2）紫外燈下顯色分析取透析處理后的熒光納米粒，統(tǒng)一固含量為 0.0025%，各取樣品 1ml 于1.5mlEP 管中，在紫外燈下照射，觀察顯色情況，結果如圖 1.6 所示

天津醫(yī)科大學碩士學位論文與稀土配合物 Eu(NTA)3的最強發(fā)射波長一致，580.2 nm、593.4 700 nm 處較弱的的特征峰成球后變的更弱，圖中幾乎看不出來成球后阻力變大也可能是納米粒中熒光配合物含量較低的原因。Eu(NTA)3 PS 熒光納米粒的激發(fā)光譜相對于 Eu(NTA)3的激發(fā)光的藍移，可能是由于稀土配合物與苯乙烯共聚，吸收的能量增加傳遞使中心離子能量發(fā)生變化，導致激發(fā)光譜藍移，這也說明稀光譜的位置明顯易受到體系環(huán)境因素的影響［49］。熒光倒置顯微鏡成像分析機選取上述 10 組中的幾組納米粒，透析后，稀釋一定的比列，片上，輕輕蓋上蓋玻片避免氣泡產生，避光存放 1-2h，待載玻片燥后，在熒光倒置顯微鏡以綠光為激發(fā)光源進行觀察，實驗結果米粒在熒光倒置顯微鏡下的圖像為例進行分析，如圖 1.8 所示。

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本文編號：2781364