【摘要】：來源于海帶的酸性多糖在結(jié)構(gòu)和組成上均表現(xiàn)出復雜、不均一的特性。采用無機酸降解海帶多糖是常用的多糖解聚方法,此外,醇沉也是傳統(tǒng)的純化海帶多糖的方法。提取過程、分離純化方法及降解流程的不同都會導致海帶多糖的分子量、結(jié)構(gòu)、組成上的差異,進而導致活性的差異。本文對海帶多糖酸解后的產(chǎn)物進行了較為系統(tǒng)的研究,通過探究海帶多糖酸解及沉降的條件,得到了多種結(jié)構(gòu)和組成較特殊的組分,并對相應組分的活性進行了考察;從酸解產(chǎn)物中制備了系列硫酸化巖藻寡糖,并對主要寡糖進行了結(jié)構(gòu)表征;探討了具有強免疫調(diào)節(jié)作用的硫酸雜多糖的細胞水平的免疫調(diào)節(jié)機制。具體的有:1通過設置降解時間、沉降濃度以及選擇不同沉降劑,對酸解得到的產(chǎn)物的化學組成及單糖組成進行了分析,通過比較,總結(jié)不同條件對產(chǎn)物的影響。在此基礎上設置不同的流程制備了7個組分(OF1、OF2、OF3、OF4、OF5、PF1和SHP),包括水解條件下斷裂的寡糖組分和較難水解的多糖組分,其中寡糖組分OF1-OF5為單糖組成以巖藻糖為主的寡糖混合物,PF1及SHP為雜多糖,分子量大于20 kD�；钚院Y選結(jié)果顯示,寡糖組分均不能刺激小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)分泌一氧化氮,而多糖組分表現(xiàn)出明顯的刺激作用;在馬兜鈴酸致大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)損傷的模型中,只有OF3和OF5在0.5 mg/mL時,以及PF1(0.5 mg/mL和1 mg/m L)表現(xiàn)出腎保護作用(p0.05),其余組分沒有活性。2結(jié)合薄層色譜、電噴霧質(zhì)譜和離子交換層析等手段,對OF1和PF1進行了化學分析及活性考察。OF1主要為硫酸化的巖藻寡糖片段,不能激活巨噬細胞,但是其離子交換層析的分級組分卻具有明顯的免疫誘導作用;在PF1分離組分中,發(fā)現(xiàn)一種葡糖巖藻半乳聚糖,其單糖組成中半乳糖:巖藻糖=2:1,具有顯著的腎保護作用。3采用凝膠過濾色譜技術對OF2進行了分離,制備了系列硫酸化巖藻寡糖共6個組分,采用串聯(lián)質(zhì)譜方法對其中的7種單硫酸化和二硫酸化巖藻寡糖進行了結(jié)構(gòu)表征,包括單硫酸化巖藻單糖、二糖、三糖、四糖(FucS、Fuc_2S、Fuc_3S、Fuc_4S),二硫酸化巖藻三糖、四糖、五糖(Fuc_3S_2、Fuc_4S_2、Fuc_5S_2)。6個組分中,只有F1、F2、F3可以抑制LPS誘導巨噬細胞的一氧化氮分泌,其他三個組分沒有活性。4 SHP為具有強免疫調(diào)節(jié)作用的低硫酸化雜多糖,經(jīng)降解后發(fā)現(xiàn)其含有的結(jié)構(gòu)單元中,以葡萄糖醛酸寡糖(聚合度1-11)和甘露葡萄糖醛酸寡糖為主,還有少量的硫酸巖藻寡糖、雜合巖藻糖-甘露糖-葡萄糖醛酸寡糖。對SHP細胞水平的免疫誘導機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)SHP作用于RAW 264.7巨噬細胞后,它可以被細胞表面Toll樣受體-4識別,并產(chǎn)生相應信號,之后激活蛋白激酶B和絲裂原活化蛋白激酶,從而將信號傳輸?shù)郊毎藘?nèi),進而激活核因子κB和激活子蛋白與炎癥相關基因結(jié)合,從而引發(fā)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R915
【圖文】：

圖 2.1 不同降解時間對 SPF1 的巖藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影響，均使用乙醇作為沉降劑。A：降解結(jié)束后 50 %終濃度沉降；B：降解結(jié)束后 70 %終濃度沉降；C：降解結(jié)束后 90 %終濃度沉降。Fig. 2.1 Effect of degradation time on the fucose, sulfate and glucoronic anid content of SPF1, andthe precipitation reagent was EtOH. A: precipitation concentration was 50 %, B: precipitationconcentration was 70 %, C: precipitation concentration was 90 %.2.1.4.3 沉降濃度對 SPF1 的巖藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影響降解 7 小時后，用不同濃度的乙醇、乙腈或丙酮進行沉降，得到的 SPF1 進行化學分析。結(jié)果如圖 2.2 顯示，當用乙醇作為沉降劑時，巖藻糖、硫酸根和糖醛酸的含量均未受到沉降濃度的影響，即多糖酸解 7 小時后，用 50 %至 90 %之間的乙醇沉降時得到的 SPF1 在化學組成上差異不大。但當用乙腈或丙酮作為沉降劑時，產(chǎn)生的 SPF1 的巖藻糖含量在 90%時最高（33.21%、42.65%），而糖醛酸含量在 90 %時最低；而當采用 50 %丙酮進行沉降時，硫酸根含量明顯降低。

圖 2.2 不同沉降終濃度對 SPF1 的巖藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影響，降解時間均為 7小時。A：沉降劑為乙醇；B：沉降劑為乙腈；C：沉降劑為丙酮。Fig. 2.2 Effect of precipitation concentration on the fucose, sulfate and glucoronic anid content ofSPF1, and the degradation time was 7 h. A: precipitation reagen was EtOH, B: precipitationreagen was can, C: precipitation reagen was acetone.2.1.4.4 沉降試劑對 SPF1 的巖藻糖、硫酸根和糖醛酸含量的影響探究沉降劑的選擇對 SPF1 化學組成的影響，從前面的結(jié)果可以看出，乙醇與乙腈、丙酮存在一定的差別。圖 2.3 展示了降解時間分別為 3 小時、5 小時和 7 小時時，用 90%的沉降劑進行沉降。降解 3 小時和 5 小時，巖藻糖的含量變化是一致的，采用丙酮作為沉降劑時巖藻糖含量最小，而采用乙腈作為沉降劑時巖藻糖含量最高；而當降解時間為 7 小時，采用丙酮沉降后得到的 SPF1 的巖藻糖含量最高。

第二章 海帶多糖的酸解方法研究及細胞活性篩選而沉降劑的不同對 SPF1 糖醛酸含量的影響在不同降解時間時表現(xiàn)不同，其中，降解 5 小時后用不同沉降劑所得的 SPF1 糖醛酸含量在 2.43 %-2.87 %之間，基本沒有差異；而降解 3 小時時，乙醇和乙腈沉降所得 SPF1 的糖醛酸含量較低（1.44%、1.38%）；降解 7 小時采用 90%乙腈沉降時糖醛酸含量最低（0.91%）。由此可見，不同降解時間時，沉降劑的選擇不同對 SPF1 的影響不同。

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