【摘要】：伊立替康(Irinotecan,IRT)在結構上屬于喜樹堿類衍生物;同時,它是一種前藥,可以在體內(nèi)羧酸酯酶(存在于血漿和多種組織中,比如肝臟,腫瘤等)的代謝下轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物SN38;在作用機制上,伊立替康屬于DNA拓撲異構酶Ⅰ(Top Ⅰ)的抑制劑,TopI參與細胞內(nèi)DNA復制與RNA轉(zhuǎn)錄等過程,在腫瘤細胞中高表達,IRT及其活性代謝產(chǎn)物SN38可通過與Top Ⅰ的結合阻礙DNA的復制,導致細胞凋亡,因此對結直腸癌,乳腺癌,卵巢癌,肺癌等多種腫瘤均有抑制作用。IRT的抗腫瘤作用強弱十分依賴于其結構中內(nèi)酯環(huán)的完整性:在pH7的酸性環(huán)境中,IRT主要以內(nèi)酯環(huán)形式存在,內(nèi)酯環(huán)形式有抗腫瘤活性;在pH7的偏堿性環(huán)境中,部分內(nèi)酯環(huán)開環(huán),失去抗腫瘤活性。目前,伊立替康的市售劑型是伊立替康的鹽酸鹽注射液,它水溶性好,但是靜脈滴注給藥會使藥物直接暴露在pH 7.4的弱堿性環(huán)境下,導致IRT內(nèi)酯環(huán)打開,活性降低,故需要增大給藥劑量以期達到預期治療效果;然而大劑量會導致一系列副作用(如嚴重腹瀉、嘔吐、中性粒細胞減少癥和嚴重抑制骨髓細胞等);除此之外,喜樹堿類藥物屬于時間依賴型藥物,換言之,該類藥物在體內(nèi)滯留時間的延長對于藥效的提高有著積極的意義。因此,尋找一種長效緩釋的藥物遞送系統(tǒng),對提高IRT療效,降低其毒副作用是十分必要的。聚合物納米粒(Polymeric Nanoparticles)作為一種新型納米載藥系統(tǒng),具有許多優(yōu)點:①它可以作為多種藥物的載體,提高其生物利用度;②一些特殊材料的應用可使聚合物納米粒具有長效、緩釋的效果;③由于粒徑合適,通�？梢酝ㄟ^EPR效應被動靶向至腫瘤部位,提高藥物的抗腫瘤效果。其中,以乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)為載體的聚合物納米�？赏ㄟ^骨架材料降解溶蝕達到緩釋藥物的目的,該骨架材料(PLGA)最終降解產(chǎn)物為水和二氧化碳,對人體無毒無害,已經(jīng)被FDA批準為藥用輔料。因此受到廣泛的關注與研究。本課題以IRT為模型藥物,以PLGA為載體材料,通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備了一種伊立替康PLGA納米粒(IRT-PLGA-Nps),主要研究內(nèi)容包括:IRT-PLGA-Nps的制備及表征;IRT-PLGA-Nps的體外釋藥特性和初步安全性評價;IRT-PLGA-Nps在昆明小鼠體內(nèi)藥物動力學評價;IRT-PLGA-Nps在荷瘤小鼠體內(nèi)藥效學評價。1.IRT-PLGA-Nps的制備及表征首先,通過紫外分光光度法(UV)建立IRT的體外含量測定方法;其次,通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備IRT-PLGA-Nps,并對可能影響IRT-PLGA-Nps包封率和載藥量的處方因素進行篩選,對可能影響IRT-PLGA-Nps粒徑的工藝因素進行篩選,確定最佳處方;最后,對最優(yōu)處方進行重現(xiàn)并對其一系列理化性質(zhì)進行表征,包括包封率,載藥量,粒徑,Zeta電位,pH,微觀形態(tài)(TEM)和物相鑒定(DSC)。結果表明,在2.55～20.4 μg/mL濃度范圍內(nèi),IRT在DMSO溶液中其吸光度與濃度之間的線性關系良好,該測定方法準確度好,精密度高,專屬性強。通過單因素篩選,考察了工藝因素(包括剪切速度和剪切時間)對納米粒粒徑的影響,確定了最佳工藝為:剪切速度為25000rpm,剪切時間為3min;同時考察了處方因素對IRT-PLGA-Nps的包封率和載藥量的影響,確定了最佳處方如下:藥脂比為1:10,初乳水相中PVA濃度為1%,分散相中PVA濃度為0.5%,油水相體積比為1:3,水相分散相體積比為1:5;根據(jù)最佳處方工藝制備的IRT-PLGA-Nps其包封率為(52.22 ±2.41)%,載藥量為(4.75 ±0.22)%,平均粒徑為(169.97± 6.29)nm,Zeta 電位為(-1.75 ±0.20)mV,pH為(6.93 ±0.04),各批次間重現(xiàn)性良好。2.IRT-PLGA-Nps體外釋藥性和初步安全性評價為考察IRT-PLGA-Nps體外釋藥特性,給體內(nèi)實驗提供一定的參考,本實驗采用動態(tài)膜透析法,以IRT-Sol為對照,考察IRT-PLGA-Nps的體外釋藥性和釋放行為。通過紫外分光光度法測定不同時間點IRT-Sol及IRT-PLGA-Nps的藥物釋放量,計算藥物不同時間點的累積釋放百分率并繪制二者的釋放曲線,用數(shù)學模型對釋放結果進行擬合,分析IRT-PLGA-Nps的體外釋放規(guī)律。此外,通過溶血試驗對IRT-PLGA-Nps安全性進行初步評價,同時考察了 IRT-PLGA-Nps在血漿中的穩(wěn)定性,為體內(nèi)應用提供依據(jù)。結果表明,IRT在釋放介質(zhì)中,濃度在2.5～20μag/mL范圍內(nèi),其吸光度與濃度之間線性關系良好,專屬性、準確度及精密度均符合測定要求。與溶液組相比,納米粒組表現(xiàn)出明顯的緩釋效果,IRT-S0l6h時累積釋放百分率為(93.94±3.98)%;IRT-PLGA-Nps 12h累積釋放百分率為(52.06± 1.65)%,192 h(8天)累積釋放百分率超過97%,釋放結果表明,IRT-PLGA-Nps開始釋放較大量的藥量,存在一定的突釋現(xiàn)象,接著緩慢釋放,維持一個較高的血藥濃度,直至藥物從IRT-PLGA-Nps中釋放完全。數(shù)學模型擬合結果顯示,IRT-Sol和IRT-PLGA-NPs的體外釋放行為均符合Weibull方程,二者的擬合方程分別為 lnln(l/(l-Q/100))=2.18181nt-0.9604(r=0.9996)和Inln(1/(1-Q/100))= 1.13 93 lnt-1.8371(r=0.9941)。24h血漿穩(wěn)定性試驗結果表明,實驗周期內(nèi),IRT-PLGA-Nps的平均粒徑較為穩(wěn)定,可滿足注射要求;溶血實驗結果顯示,在20～100μg/mL濃度范圍內(nèi),IRT-PLGA-NPs未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,溶血百分率小于5%,初步表明IRT-PLGA-NPs可安全用于靜脈注射給藥,為體內(nèi)藥物動力學實驗和藥效學實驗提供了參考依據(jù)。3.IRT-PLGA-Nps的藥物動力學評價為評價IRT-PLGA-Nps的體內(nèi)緩釋效果和藥物動力學特征,本部分以普通KM小鼠為模型動物,對IRT-PLGA-Nps進行了藥物動力學研究。首先,通過HPLC法建立了血漿中IRT(前藥)及SN38(IRT的活性代謝產(chǎn)物)的含量測定方法;然后,以IRT-Sol為對照,測定給定時間點小鼠體內(nèi)IRT和SN38的濃度,并繪制藥-時曲線;最后,通過DAS 2.0軟件分別計算IRT-PLGA-Nps和IRT-Sol進入體內(nèi)后IRT和SN38的藥物動力學參數(shù),評價IRT-PLGA-Nps的動力學特點。方法學考察結果表明,在0.04～6.4μg/mL濃度范圍內(nèi),IRT與SN38的血藥濃度與峰面積之間線性關系良好,且該方法專屬性高,準確度好,精密度高。藥物動力學實驗結果表明,經(jīng)尾靜脈注射給予IRT-PLGA-Nps和IRT-Sol后,IRT-PLGA-Nps組血漿中的IRT和SN38滯留時間均明顯大于IRT-Sol組。首先,從對前藥IRT的濃度測定結果來看,IRT-PLGA-NPs的t1/2 β,MRT和AUC值分別為IRT-Sol組的6.89倍,3.61倍和2.93倍;說明與溶液組相比,納米粒組可以顯著延長IRT在血漿里的滯留時間,提高IRT的生物利用度;其次,對代謝產(chǎn)物SN38的藥物動力學參數(shù)進行分析,IRT-PLGA-NPs的t1 2 β,MRT 和 AUC 分別是 IRT-Sol組的 2.55 倍,4.43 倍和 2.31倍,同理,說明納米粒組可以延長SN38在血漿里的滯留時間,有望使IRT的藥效得到進一步提高�？傮w而言,IRT-PLGA-NPs可提高IRT及SN38在體內(nèi)的滯留時間,這對于提高時間依賴型藥物的藥效而言是至關重要的。4.IRT-PLGA-Nps在荷瘤小鼠體內(nèi)的藥效學評價為系統(tǒng)地評價IRT-PLGA-Nps的藥效,首先以荷H22腫瘤的KM小鼠為動物模型,以生理鹽水為陰性對照,進行體內(nèi)藥效學研究,測定給定時間點的瘤體體積,繪制瘤體積-時間關系圖,并計算抑瘤率(TGI)、腫瘤特定生長率(SGR)和腫瘤倍增時間(DT),量化地評價IRT-PLGA-Nps的體內(nèi)抗腫瘤效果;同時,記錄不同時間點各組小鼠體重,可通過實驗周期內(nèi)的體重變化間接評價IRT-PLGA-Nps的毒性。然后,取出荷瘤小鼠的腫瘤組織及主要臟器(心、肝、脾、肺、腎),進行HE病理學切片觀察,通過觀察腫瘤部位的切片,定性評價IRT-PLGA-Nps的抗腫瘤效果;通過觀察主要臟器的切片評價IRT-PLGA-Nps的體內(nèi)安全性。結果表明,實驗周期內(nèi)(18天),生理鹽水組瘤體積呈現(xiàn)快速增長的趨勢,IRT-PLGA-Nps 組的 TGI 是 IRT-Sol 組的 1.3 倍,SGR 是 IRT-Sol 組的 0.47 倍,DT 是IRT-Sol組的2.13倍,說明與IRT-Sol組相比,IRT-PLGA-Nps能更好地抑制腫瘤生長;同時,統(tǒng)計學數(shù)據(jù)結果(t-Test)顯示,IRT-PLGA-Nps對小鼠體重無明顯影響(p0.05)(以生理鹽水組為對照),說明本實驗制備的納米粒毒副作用較小。小鼠的腫瘤組織的HE切片結果表明,IRT-PLGA-Nps有顯著的抑瘤效果;主要臟器HE切片各組無明顯差異,表明IRT-PLGA-Nps對小鼠主要臟器無明顯毒副作用,有一定的臨床應用潛力。結論:本課題采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了一種包封率高,載藥量高,粒徑適中的可靜脈注射給藥的IRT-PLGA-Nps,該IRT-PLGA-Nps體外釋放緩慢,安全性及穩(wěn)定性良好,藥物動力學和藥效學實驗結果表明,IRT-PLGA-Nps可以延長IRT及其代謝產(chǎn)物SN38的體內(nèi)滯留時間,抗腫瘤效果顯著增強,毒副作用降低,為其臨床應用奠定了 一定的基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943
【圖文】：

逡逑康的最大吸收波長。其光譜掃描結果如圖１－１所示：逡逑■邋＞邐—－———邐邋邐邐——－＝邐逡逑Ａ逡逑…＼邋邐逡逑0邋000邐邐二邋＾邐ｒ——ｚｒ￣邐：邐二－．■■■■邋Ｉ邋－＝：，ｒ￣￣－逡逑ｅｉ－ｎ－ｔ邋ＣＭＳ邐３００邋ｔＭｔ邐ｉｊｔｔＨＳ邐？＜？？？■＞邋ＩＷ邐ｓｏｏ邋ｏｏ逡逑光�。蓲咛崆�逡逑０邋５００邋｜邐：邐邋￣￣＾邐逡逑。\l邐／＼邋？邐Ｂ逡逑１邋＼邋／邋ｕ逡逑Ｉ邋＼邐／邐＼逡逑０邋３００邐ｉ邋Ｉ邐ｆ邐＼逡逑＾邋＼邋／邋＼逡逑0Ｍ0邐ｊ邋＼邐廠＇邐＼逡逑0＇１0°邋．邐２１９．邐＾００邐ｊ逡逑0．？0．＇？ｙＡ＇ｚＵｖ／ｖ？」邐、、－、＿邐逡逑２0）邋00邐３00邋ｏｏ邐４ｃｅ邋＜？邐ｓｏｏ邋ｏｏ逡逑波長＆－）逡逑圖１－ｌ．ＩＲＴ在ＤＭＳＯ溶液中的紫外光譜掃描結果（Ａ．輔料溶液Ｂ．邋ＩＲＴ溶液）逡逑（見實驗記錄０００４０８４－ｐ０２）逡逑Ｆｉｇ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ＵＶ邋Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋（Ａ．邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ邋ａｎｄ邋Ｂ．ＩＲＴ邋）逡逑由圖１－１可知，伊立替康ＤＭＳＯ溶液最大紫外吸收波長是３６６ｎｍ，且在此波長處，逡逑輔料對其吸收無影響，因此選擇３６６ｎｍ作為伊立替康的檢測波長。逡逑２．１．２標準曲線的制備逡逑分別精密量取濃儲液５０，邋］邋００，邋１５０，邋２００，邋３００，邋４００邋｜ａＬ置于１０ｍＬ容量瓶中，并用二逡逑甲基亞砜稀釋至刻度

按照２．３．１及２．３．２項下方法，固定基本處方和剪切時間不變（３ｍｉｎ），改變初乳逡逑剪切速度，使其分別為１５０００ｒｐｍ，２００００ｒｐｍ和２５０００ｒｐｍ，測定不同剪切速度下各個逡逑組別的粒徑變化。結果如圖１－４所示：逡逑５００－逡逑４１邋＞０７逡逑４００－逡逑Ｖ＇；＂：逡逑＾邋３００－逡逑ｉ邋W逡逑｜邋２００＂邐１５４３０逡逑－：、ｎ逡逑N邋ｒ：－－邋＿＿，丨ｖ＇ｔｌ，逡逑１５０００邐２００００邐２５０００逡逑剪切速度（ｒｐｍ）逡逑圖１－４．剪切速度對ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ粒徑的影響（ｎ＝３）逡逑（見實驗記錄０００４０８４－ｐｌ６？ｐｌ７）逡逑Ｆｉｇ邋１－４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｈｅａｒｉｎｇ邋ｒａｔｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｓｉｚｅ邋ｏｆ邋ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ逡逑２４逡逑

邐３＂逡逑剪切時間（ｍｉｎ）逡逑圖１－３？剪切時間對ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ粒徑的影響（ｎ＝３）逡逑（見實驗記錄０００４０８４－ｐｌ５？１６）逡逑Ｆｉｇ邋１－３．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｈｅａｒｉｎｇ邋ｔｉｍｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｓｉｚｅ邋ｏｆ邋ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ逡逑實驗結果表明，當剪切速度一定時，隨著剪切時間的增大，ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ的粒逡逑徑呈現(xiàn)明顯的減小趨勢，但是剪切時間若過長，一方面會對高速勻漿機有較大的損耗，逡逑散熱過多；另一方面會產(chǎn)生較多泡沫，影響納米粒的制備，因此綜合考慮后，選擇剪逡逑切時間為３ｍｉｎ。逡逑２．３．３．２剪切速度逡逑按照２．３．１及２．３．２項下方法，固定基本處方和剪切時間不變（３ｍｉｎ），改變初乳逡逑剪切速度，使其分別為１５０００ｒｐｍ，２００００ｒｐｍ和２５０００ｒｐｍ，測定不同剪切速度下各個逡逑組別的粒徑變化。結果如圖１－４所示：逡逑５００－逡逑４１邋＞０７逡逑４００－逡逑Ｖ＇；＂：逡逑＾邋３００－逡逑ｉ邋W逡逑｜邋２００＂邐１５４３０逡逑－：、ｎ逡逑N邋ｒ：－－邋＿＿，丨ｖ＇ｔｌ，逡逑１５０００邐２００００邐２５０００逡逑剪切速度（ｒｐｍ）逡逑圖１－４．剪切速度對ＩＲＴ－ＰＬＧＡ－Ｎｐｓ粒徑的影響（ｎ＝３）逡逑（見實驗記錄０００４０８４－ｐｌ６？ｐｌ７）逡逑Ｆｉｇ邋１－４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｓｈｅａｒｉｎｇ邋ｒａｔｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐａｒｔｉｃｌｅ邋ｓｉｚｅ邋ｏｆ邋ＩＲＴ－Ｐ

【參考文獻】

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本文編號：2771090