【摘要】：手性苯基環(huán)氧乙烷(SO)和手性芐基縮水甘油醚(BGE)是合成很多藥物的重要前體物。如(S)-SO可作為合成反苯環(huán)丙胺結(jié)構(gòu)的原料,用于合成抗腫瘤,抗抑郁以及治療急性冠脈綜合征等藥物。(R)-BGE是合成抗腫瘤藥物SPIKET-P和番荔枝內(nèi)酯的重要前體物,在抗白血病方面有著重要價值。(S)-BGE是很多免疫抑制劑的重要結(jié)構(gòu)部分,可用于合成天然產(chǎn)物二乙酸隱花甘藍(lán)。該藥在治療頭痛,晨吐以及抗癌甚至在藻類信息素前體的合成等領(lǐng)域具有重要的研究價值。本文根據(jù)文獻(xiàn)報道,合成了Agromyces mediolanus環(huán)氧化物水解酶(EH-Am)的基因序列,并將此基因?qū)氪竽c桿菌質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)。通過單因素優(yōu)化,得出最優(yōu)表達(dá)條件:誘導(dǎo)劑濃度為0.2 mM,誘導(dǎo)溫度為28℃,誘導(dǎo)時間為8 h。對EH-Am的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),此酶的最適pH為8.0,最適反應(yīng)溫度為35℃。溫度穩(wěn)定性結(jié)果顯示,30℃時的半衰期為51.14 h,而50℃的半衰期為4.74 h。首先,利用EH-Am拆分外消旋SO制備手性SO。結(jié)果顯示,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.06 mM,反應(yīng)10 h后(R)-SO的ee值99%,收率為25%。對兩個構(gòu)型底物之間的相互抑制以及產(chǎn)物抑制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,(S)-SO能顯著抑制(R)-SO的水解,(S)-SO的水解產(chǎn)物產(chǎn)物(S)-1-苯基-1,2-乙二醇對(S)-SO水解存在較強(qiáng)抑制。底物濃度研究結(jié)果顯示,當(dāng)SO濃度大于2.11 mM時,(R)-SO的ee值較低。通過底物補(bǔ)加的方式,(R)-SO的收率由24.8%提高到33.2%(底物濃度2.11 mM);向反應(yīng)體系中加入一定量的吐溫20表面活性劑,(R)-SO的收率則提高到34.2%。接著利用EH-Am拆分外消旋BGE制備手性BGE。結(jié)果顯示,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.72 mM,反應(yīng)6 h后(S)-BGE的ee值99%,收率為34%。對兩個構(gòu)型底物之間的相互抑制以及產(chǎn)物抑制進(jìn)行了研究,結(jié)果表明(R)-BGE能顯著抑制(S)-BGE的水解,(R)-BGE的水解產(chǎn)物產(chǎn)物(R)-3-芐基-1,2-丙二醇對(R)-BGE水解存在較強(qiáng)抑制。底物濃度對(S)-BGE的ee值和產(chǎn)率有顯著影響,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.672 mM時,(S)-BGE的ee值99%,收率達(dá)40.1%。隨著底物濃度的提高,(S)-BGE的收率逐漸下降。當(dāng)外消旋BGE濃度為10.75 mM時,(S)-BGE的收率只有21.2%;若繼續(xù)提高底物濃度,(S)-BGE的ee值則達(dá)不到99%。通過底物補(bǔ)加的方式,當(dāng)濃度為10.75 mM時,(S)-BGE的收率為由原來的21.2%提高到26.9%;在反應(yīng)體系加入一定量的表面活性劑Triton X-100,(S)-BGE的收率則提高到35.9%。
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

1 環(huán)氧化物水解酶拆分外消旋苯基環(huán)氧乙烷合成手性苯基環(huán)氧乙烷nthesis of chiral phenyl epoxy ethane by resolution of racemic phenyl epith epoxide hydrolase.氧化物水解酶的作用原理化物水解酶的結(jié)構(gòu)各有不同，來自動物體內(nèi)和來自植物的酶的結(jié)構(gòu)具。來源于哺乳動物的可溶性環(huán)氧化物水解酶和微粒體環(huán)氧化物水解酶末端區(qū)域，但其同源性非常差，而從植物里得到的環(huán)氧化物水解酶卻。環(huán)氧化物水解酶的基因序列以及空間結(jié)構(gòu)[36]，環(huán)氧化物水解酶一共：第一類屬于 α 螺旋型，而另一種則屬于 β 折疊型。環(huán)氧化物水解酶也有兩個：其一是帽子結(jié)構(gòu)，其二是核心結(jié)構(gòu)，分別由 5 個 α 螺旋組成。根據(jù)文獻(xiàn)報道，環(huán)氧化物水解酶的的功能結(jié)構(gòu)一般是由天冬氨構(gòu)成。具體的催化機(jī)制分為兩個步驟，第一步天冬氨酸殘基攻擊含環(huán)原子，生成共價酯中間體；第二步，另一個天冬氨酸殘基參與下，組

相檢測條件[49]：安捷倫 1260 系統(tǒng)，(1) XDB-C18 反相柱50mm)，進(jìn)樣量 20 μL，流動相為乙醇/水 (75∶25)，檢測波長 230℃，流速 1 mL/min；(2) CHIRALPAK AS-H 手性柱 (5 μm 4進(jìn)樣量 20 μL，流動相為正己烷/異丙醇 (95∶5)，檢測波長 230℃，流速 1 mL/min。結(jié)果與討論 重組菌的構(gòu)建載體用雙酶切法切開，再將 EH-Am 基因片段嵌入載體[50]， pET28a-EH，結(jié)果如圖 2-1。雙酶切電泳結(jié)果如圖 2-2 兩個數(shù)量與載體以及基因堿基對數(shù)量相吻合，證明了重組質(zhì)粒的后將載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，得到重組 E.coli DE3/pET28a-EH。

圖 2-2 重組質(zhì)粒 pET28a-EH 酶切電泳圖el electrophoresis of pET28a-EH treated with restriA;Lane2: Digested with NcoI/XhoI;Lane M: DNA Mark腸桿菌活力測定oli DE3/pET28a-EH 的酶活檢測結(jié)果如表 2 DE3 沒有檢測出酶活，沒有經(jīng)過誘導(dǎo)的H 也沒有檢測出活力，而經(jīng)過 0.2 mM 誘導(dǎo)劑H 的菌體檢測有酶活，酶活為 5.79 U/L，說明活性。表 2-2 重組菌 E.coli DE3/pET28a-EH 酶活檢

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