【摘要】：研究背景胃癌是最常見的惡性腫瘤,也是在腫瘤死亡率中排名前三的惡性腫瘤。我國胃癌患者的比例近些年在不斷增加,占全球胃癌患者總數(shù)的比例超過40%,死亡率也明顯高出其他國家。目前臨床上對早期胃癌診斷的缺乏以及病人本身對自身胃部疾病的忽視,導(dǎo)致胃癌得到診斷時一般已經(jīng)是中晚期,因此胃癌患者的五年生存率在5%以下。深入揭示胃癌的發(fā)生發(fā)展機制以及尋求新的具有臨床使用價值的藥物靶點至關(guān)重要。幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori,Hpylori)可引發(fā)萎縮性胃炎、非萎縮性胃炎和腸型胃癌,進而發(fā)展為彌漫型胃癌。幽門螺旋桿菌刺激上皮細胞,使中性粒細胞積聚,產(chǎn)生炎癥介質(zhì)、活性氧和氮物種,從而破壞胃黏膜上皮細胞,導(dǎo)致DNA損傷和細胞功能異變。針對作用對象不同,表觀遺傳調(diào)節(jié)可以分為對DNA、組蛋白、Non-coding RNA和染色質(zhì)的調(diào)控。表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的異常與人類疾病包括炎癥性疾病、代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等息息相關(guān),相關(guān)致病機制不斷被闡明揭示。目前針對表觀基因組調(diào)節(jié)因子的小分子抑制劑的研究越來越廣泛深入,并且在臨床上已有去乙�；敢种苿┖虳NA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑被批準用于應(yīng)用,更多針對調(diào)控表觀遺傳的藥物前體正在臨床試驗中。RBP2屬于組蛋白去甲基化酶KDM5家族,具有JmjC結(jié)構(gòu)域,通過輔因子Fe(Ⅱ)和α-Ketoglutaricacid(α-KG)的雙加氧酶反應(yīng)使組蛋白H3上的二甲基化和三甲基化賴氨酸4去甲基化。根據(jù)目前已有文獻證明,RBP2參與腫瘤細胞的許多生物學功能過程,包括增殖、遷移、侵襲、凋亡及自噬等過程,在胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、白血病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用;RBP2的高表達還與腫瘤患者預(yù)后不良緊密相關(guān)。本課題組已經(jīng)證明RBP2能夠促進幽門螺旋桿菌介導(dǎo)的胃黏膜上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化與侵襲轉(zhuǎn)移。綜上所述,針對在幽門螺旋桿菌所介導(dǎo)的胃炎到胃癌的惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用的調(diào)控分子RBP2設(shè)計阻斷劑,可以為胃癌的早期預(yù)防和靶向治療提供新選擇。研究目的以藥效團己胺甲�；螢楹诵�,設(shè)計合成特異性抑制組蛋白去甲基化酶RBP2活性的小分子化合物,篩選獲得潛在抑制RBP2酶活性的小分子化合物藥物前體,并在胃癌模型中進行相關(guān)的生物學功能驗證,為臨床針對RBP2所致疾病的治療提供更多的選擇。研究方法與結(jié)果1.化合物WXSA-055B通過抑制RBP2能促進胃癌細胞BGC-823中H3K4me3的表達,并調(diào)控RBP2下游靶基因。使用Western-blot,檢測化合物WXSA-055B在人體胃癌細胞BGC-823中對RBP2、組蛋白H3K4me3 水平、以及RBP2下游靶基因p21、p27、CCND1的表達。結(jié)果顯示W(wǎng)XSA-055B能夠抑制人胃癌細胞BGC-823中RBP2的表達,并使RBP2組蛋白去甲基化酶活性功能受到抑制,促進酶底物H3K4me3的表達升高,同時調(diào)控RBP2下游靶分子產(chǎn)生相對應(yīng)的變化。同時通過EdU實驗和Transwell小室檢測,結(jié)果表明化合物WXSA-055B不調(diào)控BGC-823的增殖和遷移功能。2.化合物WXSA-059A下調(diào)胃癌細胞BGC-823中RBP2蛋白水平,調(diào)控RBP2下游靶基因,抑制細胞的增殖。對胃癌細胞BGC-823進行化合物WXSA-059A處理,使用Western-blot檢測RBP2、H3K4me3、p21、CCND1的變化,同時通過EdU實驗檢測細胞的增殖能力。實驗結(jié)果表明,化合物WXSA-059A能夠調(diào)控RBP2及其下游靶基因,從而顯著降低BGC-823細胞的增殖能力。3.化合物WXSA-051B抑制RBP2表達,促進RBP2酶活性底物H3K4me3表達增加,促進BGC凋亡相關(guān)蛋白的表達,抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力。對胃癌細胞BGC-823進行化合物WXSA-051B處理后,檢測細胞的蛋白以及生物學功能變化。實驗結(jié)果表明,化合物WXS-051B處理后,BGC-823細胞中RBP2表達下降,H3K4me3水平、Caspase-3表達上升。同時對處理后的細胞進行增殖EdU檢測、流式分析以及Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn),化合物WXSA-051B處理后,BGC-823細胞的增殖和遷移能力均受到明顯抑制,但細胞凋亡情況未發(fā)生改變。4.化合物WXSA-082B抑制RBP2并調(diào)控其下游,上調(diào)RBP2酶底物H3K4me3水平,促進凋亡相關(guān)蛋白表達增加,抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力。對胃癌細胞BGC-823進行化合物WXSA-082B處理后,檢測相應(yīng)蛋白變化以及生物學功能驗證。實驗結(jié)果表明,化合物WXS-082B處理后,BGC-823細胞中RBP2表達下降,H3K4me3、Caspase-3、PARP1表達上升。同時處理后的細胞進行增殖EdU檢測、流式分析以及Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn),化合物WXSA-082B處理后,BGC-823細胞的增殖能力和遷移能力明顯降低,但細胞凋亡無顯著變化。5.化合物WXSA-072A抑制胃癌BGC-823細胞中RBP2表達,促進RBP2酶活性底物H3K4me3水平上升,促進BGC-823凋亡相關(guān)蛋白的表達和胃癌細胞的凋亡,抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力。對胃癌細胞BGC-823進行化合物WXSA-072A處理后,檢測相應(yīng)蛋白變化以及功能驗證。實驗結(jié)果表明,化合物WXS-072A處理后,BGC-823細胞中RBP2表達減少,H3K4me3水平和Caspase-3表達上調(diào)。同時處理后的細胞進行增殖EdU檢測、流式分析以及Transwell小室檢測發(fā)現(xiàn),化合物WXSA-072A處理后,BGC-823細胞的增殖和遷移能力受抑制,凋亡細胞顯著增多。研究結(jié)論1.化合物WXSA-055B僅在蛋白水平對RBP2表達及其調(diào)控的H3K4me3水平有所影響,進而導(dǎo)致胃癌細胞中RBP2的下游靶分子表達變化,但并不影響細胞的生物學功能;2.化合物WXSA-059A在蛋白水平影響RBP2及其下游靶分子,可以抑制胃癌細胞的增殖能力,但不抑制RBP2去甲基化酶作用;3.化合物WXSA-051B與WXSA-082B在蛋白水平調(diào)控RBP2和RBP2酶底物H3K4me3水平,并且影響其下游靶分子,抑制胃癌細胞增殖和遷移能力;4.化合物WXSA-072A在蛋白水平調(diào)控RBP2及其酶底物H3K4me3水平,影響RBP2的下游靶分子,從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移能力,促進胃癌細胞發(fā)生凋亡。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914

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