【摘要】：Ⅲ類羊毛硫肽類化合物是RiPPs家族中一類重要的天然產(chǎn)物,在其生物合成過程中,III類合成酶LanKC對前體肽進(jìn)行脫水環(huán)化等一系列修飾,最后形成具有生物活性的成熟RiPPs。LanKC是一個(gè)三功能合成酶修飾,帶有一個(gè)N-端裂解酶結(jié)構(gòu)域,一個(gè)中心激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)推定的C-末端環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域。序列分析發(fā)現(xiàn)LanKC的N-端區(qū)域(LanKC-lyase)和OspF家族蛋白具有較高的序列相似性且具有相同的保守序列。OspF蛋白家族是一類磷酸蘇氨酸裂合酶,它能夠通過去磷酸化MAPK激酶中的磷酸蘇氨酸,抑制MAPK信號通路,從而影響細(xì)胞的生長、分化、對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)和炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理、病理過程。我們利用異源表達(dá),點(diǎn)突變和體外生化實(shí)驗(yàn)研究LanKC的N-端結(jié)構(gòu)域的功能和構(gòu)效關(guān)系。通過LanKC-lyase與包含pSer的小肽進(jìn)行反應(yīng),經(jīng)過LC-MS分析,我們初步得到脫磷酸的產(chǎn)物。對該酶進(jìn)行酶促動力學(xué)分析,結(jié)果顯示LanKC-lyase的Km為50μM,Kcat為0.78/S。進(jìn)一步對LanKC-lyase中7個(gè)保守氨基酸進(jìn)行突變,體外反應(yīng)結(jié)果顯示,7個(gè)突變后的蛋白活性均有所降低,其中K94A位點(diǎn)突變后對酶活性的影響較為顯著,R128A氨基酸突變后對酶活性影響相對較小,其余5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變也均對coeKC-lyase的酶活性產(chǎn)生了一定影響。LanKC蛋白與OspF家族蛋白在功能上的重要區(qū)別在于:OspF家族蛋白識別宿主MAPK中的一種特異性磷酸化蘇氨酸,而LanKC蛋白識別其前體肽中包含的所有磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸。我們的研究初步揭示了LanKClyase的催化機(jī)理,進(jìn)一步結(jié)合LanKC-lyase的蛋白結(jié)構(gòu),探究其功能和構(gòu)效之間的關(guān)系,可為Ⅲ類羊毛硫肽的組合生物合成提供理論基礎(chǔ),最終為藥物篩選提供有效的前體分子。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 1.1 RiPPs 的通用合成途徑Figure 1.1 General synthetic route of RiPPs一般地，先由核糖體合成一段前體肽（Precursorpeptide），這段前體肽主要包括四個(gè)部分：前端的信號肽（Signal）、前導(dǎo)肽（Leaderpeptide）、核心肽（Corpeptide）以及識別序列（RecognitionSequence）。前導(dǎo)肽作為識別信號被基因簇中的其他修飾酶所識別，修飾酶對核心肽部分進(jìn)行一系列的修飾，接著前導(dǎo)肽部分會被特定的蛋白酶水解，釋放出成熟的具有生物活性的 RiPPs[16]。（2）羊毛硫肽合成機(jī)制在核糖體合成翻譯后修飾多肽中，羊毛硫肽是其中重要的一類。羊毛硫肽中具有特殊的包含硫醚交聯(lián)的羊毛硫氨酸（Lan）和甲基羊毛硫氨酸（MeLan）結(jié)構(gòu)，其中具有抗微生物活性的羊毛硫肽被稱為羊毛硫抗生素。此類多肽在生物合成過程中，前體肽中的 Ser 和 Thr 會首先發(fā)生脫水形成 Dha 和 Dhb 殘基，后 Dh和 Dhb 殘基和前體肽中包含的半胱氨酸殘基發(fā)生米歇爾加成，分別形成 Lan 和

圖 1.2 羊毛硫肽的分類Figure 1.2 Classification of lanthiopeptides（3）羊毛硫抗生素的應(yīng)用前景羊毛硫抗生素是一類重要的具有抗菌活性的肽類化合物。其中，michiganinA 對一些革蘭氏陽性菌具有有效的抑制作用，它能夠抑制一些與其產(chǎn)生菌親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌；也有一些抗菌肽如 microbisporicin 可抑制諸多種類的革蘭氏陽性菌，其中也包括一些在臨床上具有高度耐藥性的病原菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌等；Cinnamycin 可以抗一部分的革蘭氏陽性菌，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗真菌能力，并且對 I 型單純性皰疹病毒的增殖也具有一定的抑制作用；作為食品保鮮劑，羊毛硫肽抗生素中最早發(fā)現(xiàn)也是研究最清楚的羊毛硫肽類抗生素 Nisin，現(xiàn)已經(jīng)在工業(yè)史上存在近 50 年左右，另一種食品保鮮劑 Variacin，也被認(rèn)為有著巨大的經(jīng)濟(jì)潛力，該類羊毛硫抗生素可抑制大多數(shù)引起食物腐敗的革蘭氏陽性菌，其不僅能耐高溫環(huán)境，更是在

圖 1.3 毒力因子注入真核細(xì)胞并操縱宿主細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑ure 1.3 Injecting virulence factors into eukaryotic cells and manipulating hostsignaling pathways泌裝置具有一個(gè)類似針形的小分子結(jié)構(gòu)，此裝置可以直接將效應(yīng)蛋到宿主細(xì)胞中，此過程也可以逃避宿主的識別系統(tǒng)[48]。進(jìn)入宿主蛋白通過干擾宿主細(xì)胞的 MAPK 通路從而阻止細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答的免疫抑制中起到重要的作用[49]。F 家族 家族是一類磷酸蘇氨酸裂解酶，這類裂解酶包括已知的效應(yīng)蛋白其可以特異的識別磷酸化的 MAPK（p-MAPK）氨基酸序列中保結(jié)構(gòu)，磷酸蘇氨酸裂解酶活性將 MAPK 活性所需的磷酸蘇氨酸轉(zhuǎn)，一種含有不飽和 Ca-Cb 雙鍵的烯烴。磷酸基團(tuán)的這種 β-消除導(dǎo)，這種修飾可將其稱為消除化，修飾結(jié)果是產(chǎn)生不飽和的氨基酸（圖

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本文編號：2762781