【摘要】：Ⅲ類羊毛硫肽類化合物是RiPPs家族中一類重要的天然產(chǎn)物,在其生物合成過程中,III類合成酶LanKC對前體肽進行脫水環(huán)化等一系列修飾,最后形成具有生物活性的成熟RiPPs。LanKC是一個三功能合成酶修飾,帶有一個N-端裂解酶結(jié)構(gòu)域,一個中心激酶結(jié)構(gòu)域和一個推定的C-末端環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域。序列分析發(fā)現(xiàn)LanKC的N-端區(qū)域(LanKC-lyase)和OspF家族蛋白具有較高的序列相似性且具有相同的保守序列。OspF蛋白家族是一類磷酸蘇氨酸裂合酶,它能夠通過去磷酸化MAPK激酶中的磷酸蘇氨酸,抑制MAPK信號通路,從而影響細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應和炎癥反應等多種重要的細胞生理、病理過程。我們利用異源表達,點突變和體外生化實驗研究LanKC的N-端結(jié)構(gòu)域的功能和構(gòu)效關(guān)系。通過LanKC-lyase與包含pSer的小肽進行反應,經(jīng)過LC-MS分析,我們初步得到脫磷酸的產(chǎn)物。對該酶進行酶促動力學分析,結(jié)果顯示LanKC-lyase的Km為50μM,Kcat為0.78/S。進一步對LanKC-lyase中7個保守氨基酸進行突變,體外反應結(jié)果顯示,7個突變后的蛋白活性均有所降低,其中K94A位點突變后對酶活性的影響較為顯著,R128A氨基酸突變后對酶活性影響相對較小,其余5個氨基酸位點的突變也均對coeKC-lyase的酶活性產(chǎn)生了一定影響。LanKC蛋白與OspF家族蛋白在功能上的重要區(qū)別在于:OspF家族蛋白識別宿主MAPK中的一種特異性磷酸化蘇氨酸,而LanKC蛋白識別其前體肽中包含的所有磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸。我們的研究初步揭示了LanKClyase的催化機理,進一步結(jié)合LanKC-lyase的蛋白結(jié)構(gòu),探究其功能和構(gòu)效之間的關(guān)系,可為Ⅲ類羊毛硫肽的組合生物合成提供理論基礎(chǔ),最終為藥物篩選提供有效的前體分子。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R91
【圖文】：

圖 1.1 RiPPs 的通用合成途徑Figure 1.1 General synthetic route of RiPPs一般地，先由核糖體合成一段前體肽（Precursorpeptide），這段前體肽主要包括四個部分：前端的信號肽（Signal）、前導肽（Leaderpeptide）、核心肽（Corpeptide）以及識別序列（RecognitionSequence）。前導肽作為識別信號被基因簇中的其他修飾酶所識別，修飾酶對核心肽部分進行一系列的修飾，接著前導肽部分會被特定的蛋白酶水解，釋放出成熟的具有生物活性的 RiPPs[16]。（2）羊毛硫肽合成機制在核糖體合成翻譯后修飾多肽中，羊毛硫肽是其中重要的一類。羊毛硫肽中具有特殊的包含硫醚交聯(lián)的羊毛硫氨酸（Lan）和甲基羊毛硫氨酸（MeLan）結(jié)構(gòu)，其中具有抗微生物活性的羊毛硫肽被稱為羊毛硫抗生素。此類多肽在生物合成過程中，前體肽中的 Ser 和 Thr 會首先發(fā)生脫水形成 Dha 和 Dhb 殘基，后 Dh和 Dhb 殘基和前體肽中包含的半胱氨酸殘基發(fā)生米歇爾加成，分別形成 Lan 和

圖 1.2 羊毛硫肽的分類Figure 1.2 Classification of lanthiopeptides（3）羊毛硫抗生素的應用前景羊毛硫抗生素是一類重要的具有抗菌活性的肽類化合物。其中，michiganinA 對一些革蘭氏陽性菌具有有效的抑制作用，它能夠抑制一些與其產(chǎn)生菌親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌；也有一些抗菌肽如 microbisporicin 可抑制諸多種類的革蘭氏陽性菌，其中也包括一些在臨床上具有高度耐藥性的病原菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌等；Cinnamycin 可以抗一部分的革蘭氏陽性菌，同時也發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗真菌能力，并且對 I 型單純性皰疹病毒的增殖也具有一定的抑制作用；作為食品保鮮劑，羊毛硫肽抗生素中最早發(fā)現(xiàn)也是研究最清楚的羊毛硫肽類抗生素 Nisin，現(xiàn)已經(jīng)在工業(yè)史上存在近 50 年左右，另一種食品保鮮劑 Variacin，也被認為有著巨大的經(jīng)濟潛力，該類羊毛硫抗生素可抑制大多數(shù)引起食物腐敗的革蘭氏陽性菌，其不僅能耐高溫環(huán)境，更是在

圖 1.3 毒力因子注入真核細胞并操縱宿主細胞信號傳導途徑ure 1.3 Injecting virulence factors into eukaryotic cells and manipulating hostsignaling pathways泌裝置具有一個類似針形的小分子結(jié)構(gòu)，此裝置可以直接將效應蛋到宿主細胞中，此過程也可以逃避宿主的識別系統(tǒng)[48]。進入宿主蛋白通過干擾宿主細胞的 MAPK 通路從而阻止細胞發(fā)生免疫應答的免疫抑制中起到重要的作用[49]。F 家族 家族是一類磷酸蘇氨酸裂解酶，這類裂解酶包括已知的效應蛋白其可以特異的識別磷酸化的 MAPK（p-MAPK）氨基酸序列中保結(jié)構(gòu)，磷酸蘇氨酸裂解酶活性將 MAPK 活性所需的磷酸蘇氨酸轉(zhuǎn)，一種含有不飽和 Ca-Cb 雙鍵的烯烴。磷酸基團的這種 β-消除導，這種修飾可將其稱為消除化，修飾結(jié)果是產(chǎn)生不飽和的氨基酸（圖

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本文編號：2762781