發(fā)布時(shí)間：2020-07-14 15:16

【摘要】：嘔吐毒素,又名DON(deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇),屬于單端孢霉烯族類化合物,是一類強(qiáng)有力的免疫抑制劑。DON易感染谷物、玉米、紅薯等常用農(nóng)作物,除此之外,還會(huì)污染動(dòng)物的次生代謝產(chǎn)物,如豬肉、牛奶、羊血等。因此,對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅,特別是對(duì)免疫功能具有明顯的影響。豬是對(duì)其最敏感的家畜之一,而腸道作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所,也是DON攻擊的第一靶標(biāo)。DON有很高的免疫抑制和細(xì)胞毒素作用,根據(jù)DON的劑量和作用時(shí)間不同可引起免疫刺激或免疫抑制。當(dāng)人食用了被DON污染的食物后,會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、發(fā)燒、腹瀉、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)影響造血系統(tǒng)甚至死亡。中國傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于西方,使得嘔吐毒素的危害更為突出。目的:通過空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2為模型,篩選合適的DON作用濃度和時(shí)間。從CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率;細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè);Werstem-Blot檢驗(yàn)Caspase3(17)和Caspase3(32)的表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量分別檢測(cè)相對(duì)定量中細(xì)胞因子、線粒體氧化應(yīng)激、游離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相關(guān)目的基因表達(dá)量。通過這些指標(biāo)來觀測(cè)DON對(duì)IPEC-J2凋亡和功能的影響。方法:1)不同濃度DON作用不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞CCK-8增殖實(shí)驗(yàn):用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞,進(jìn)行24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)培養(yǎng),設(shè)置低濃度200ng/mlDON,高濃度2000ng/mlDON,通過測(cè)量培養(yǎng)基OD值計(jì)算細(xì)胞相對(duì)生存率。2)不同DON濃度處理后IPCE-J2細(xì)胞周期檢測(cè):用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,用高濃度2000ng/mlDON、低濃度200ng/m1DON處理細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí),按照試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,分析PI熒光直方圖上細(xì)胞各周期的百分率。3)不同DON濃度處理后IPCE-J2細(xì)胞凋亡檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)同上,按照試劑盒操作,在流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè),收集閃點(diǎn)圖,進(jìn)行凋亡率統(tǒng)計(jì)。4)DON處理后IPEC-J2細(xì)胞在Caspase3基因上的蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)同上,加入50ulRIPA裂解液,裂解。檢測(cè)蛋白濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色曝光、灰度分析、數(shù)據(jù)處理。5)DON處理后IPEC-J2細(xì)胞在(細(xì)胞因子、線粒體氧化應(yīng)激、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體)基因上的qRTPCR實(shí)驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)和DON處理,提取RNA、RNA濃度測(cè)定、DNA去除反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量、數(shù)據(jù)處理。結(jié)果:1)DON對(duì)IPEC-J2細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著影響,抑制細(xì)胞增殖。選取24小時(shí)為終止時(shí)間段,分別進(jìn)行6、12、24小時(shí)的研究。2)200ng/mlDON組細(xì)胞有絲分裂更多停留在S期,2000ng/mlDON更多停留在G2/M期。3)DON作用短時(shí)間6小時(shí),細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率隨著DON濃度上升而增高。4)DON激活細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶Caspase3(17)片段,作用時(shí)間在6小時(shí)效果顯著。5)細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá):高濃度2000ng/mlDON兩個(gè)基因表達(dá)上均顯著升高,顯著激活I(lǐng)L-8、IL-1β炎癥基因的表達(dá)。線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá):DON作用12小時(shí)后高濃度2000ng/ml使TFAM、mtSSB、ND4、CCOXIV表達(dá)量顯著上升,Cytc在24小時(shí)表達(dá)量增高。游離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá):DON在作用12小時(shí)會(huì)抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)游離氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體Bo+AT的表達(dá),24小時(shí)后抑制SGLT1、ASCT2、GIUT2表達(dá)。結(jié)論:DON對(duì)IPEC-J2細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著影響,通過抑制其增殖,誘導(dǎo)凋亡和刺激炎癥反應(yīng)等來實(shí)現(xiàn)。其中低濃度200ng/mlDON使細(xì)胞有絲分裂停留在S期;高濃度DON使細(xì)胞周期停留在有絲分裂后期G2/M期。在細(xì)胞凋亡上DON主要作用在6小時(shí)或之前時(shí)間段,此結(jié)果與在6小時(shí)左右啟動(dòng)了 Caspase3基因有關(guān)。高濃度 2000ng/mlDON 作用 12 小時(shí) TFAM、mt SSB、ND4、CCOXV、CCOXIV表達(dá)量上升。mtSSB表達(dá)失調(diào),mtDNA發(fā)生基因突變,如高氧化應(yīng)激、水解脫氨基反應(yīng)、烷基化作用,DNA損傷將大量積累,最終導(dǎo)致多種相關(guān)疾病的發(fā)生。ND4基因促使遺傳性視神經(jīng)病,線粒體肌病,張力障礙等相關(guān)疾病發(fā)生。CCOXIV基因促使細(xì)胞色素加深,細(xì)胞膜趨向老化。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)中DON處理低濃度和高濃度作用12小時(shí)在Bo+AT、SGLT1表達(dá)上均有下降,說明此濃度DON抑制糖類被動(dòng)吸收,阻礙果糖和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn),小腸轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的效率降低,從而引起代謝障礙,其中低濃度200ng/ml作用更明顯。
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R99
【圖文】：

１．５實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．５．１數(shù)據(jù)分析逡逑結(jié)果圖１，使用ＳＰＳＳ邋Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋２２—般線性模型，單變量，因變量為生存率，固定逡逑因子為濃度和時(shí)間，黏貼制定程序如下：邐逡逑ＤＡＴＡＳＥＴ邋ＡＣＴＩＶＡＴＥ邋數(shù)據(jù)集邋０．逡逑ＵＮＩＡＮＯＶＡ生存率ＢＹ時(shí)間濃度逡逑／ＭＥｍ0Ｄ＝ＳＳＴＹＰＥ（３）逡逑／ＩＮＴＥＲＣＥＰＴ－ＩＮＣＬＵＤＥ逡逑／ＰＯＳＴＨＯＣ＝時(shí)間濃度（ＳＮＫ）逡逑／ＣＲＩＴＥＲＩＡ＝ＡＬＰＨＡ（０．０５）逡逑／ｅ＿ｅａｎｓ＝ＴＡＢＬＥＳ（時(shí)間邋＊濃度）ＣＯＭＰＡＲＥ（濃度）ＡＤＪ（ＬＳＤ）逡逑／ｅ＿ｅａｎｓ＝ＴＡＢＬＥＳ（濃度＊時(shí)間）ＣＯＭＰＡＲＥ邋（時(shí)間）ＡＤＪ（ＬＳＤ）逡逑／ＤＥＳＩＧＮ＝時(shí)間濃度時(shí)間＊濃度．邐逡逑進(jìn)行組內(nèi)組間比較。在同一時(shí)間段與對(duì)照組相比

圖２不同ＤＯＮ濃度處理不同時(shí)間的細(xì)胞周期熒光直方圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ａｎｄ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ｔｉｍｅ邋ｆｏｒ邋ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ（ＤＯＮ）逡逑ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ逡逑２．３．２數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析逡逑結(jié)果圖３，使用ＳＰＳＳ＿Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ＿２２比較均值，單因素ＡＮＯＶＡ檢驗(yàn)。低濃度逡逑２００ｎｇ／ｍｌＤＯＮ在ＩＰＥＣ－Ｊ２細(xì)胞有絲分裂早期（Ｇ０／Ｇ１）有促進(jìn)作用（ｐ＜０．０５）；邋Ｓ期細(xì)胞增多逡逑0？＜０．０５）；Ｇ２／Ｍ期無差異0？＞０．０５）。氋濃度２０００ｎｇ／ｍｌＤＯＮ在Ｇ０／Ｇ１和Ｓ期無顯著差異逡逑（ｐ＞０．０５）；邋Ｇ２／Ｍ邋期細(xì)胞顯著增多（ｐ＜０．０５）。逡逑８逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2755133