發(fā)布時間：2020-07-11 16:06

【摘要】：多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX)是一種由紫杉烷類化合物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)經(jīng)結(jié)構(gòu)改造得到的具有廣譜高效的抗腫瘤活性的半合成化合物,其治療效果是紫杉醇的2-4倍,臨床上,多烯紫杉醇在實體瘤如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和頭、頸部腫瘤的治療上發(fā)揮重要作用。但隨著多烯紫杉醇在臨床上使用的廣泛,一些問題逐漸顯現(xiàn)出來。首先,多烯紫杉醇在水中的溶解度極低(5-6μg/ml),因此不能均勻地分散在體液中,這使其很容易從體液循環(huán)中被清除。臨床上常見的多烯紫杉醇制劑如泰索帝(?)(Taxotere(?))和多帕菲(?)(Duopafei(?))等主要使用乙醇等有機(jī)溶劑和非離子表面活性劑Tween-80對多烯紫杉醇進(jìn)行增溶,然而有機(jī)溶劑和表面活性劑的使用會造成溶血反應(yīng)和超敏反應(yīng)等不良反應(yīng),嚴(yán)重降低了患者對制劑的耐受性。另外,多烯紫杉醇本身的毒副作用如肝損傷,中性粒細(xì)胞減少癥等和由長期用藥所導(dǎo)致的多藥耐藥性(Multi-drug resistance,MDR)也限制了多烯紫杉醇的廣泛應(yīng)用。因此,設(shè)計一種合適的多烯紫杉醇制劑,提高多烯紫杉醇的水溶性,降低多烯紫杉醇以及制劑輔料等帶來的毒副作用,高效地將多烯紫杉醇輸送至腫瘤組織,提高多烯紫杉醇的生物利用度及抑瘤能力是非常必要的。兩親性藥物-載體結(jié)合物是由疏水性的藥物和親水性的載體經(jīng)由活性基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)或特定的連接體共價連接而獲得的兩親性結(jié)合物,在水溶液中可以自組裝形成膠束以增溶難溶性藥物。與傳統(tǒng)的膠束相比,由兩親性的藥物-載體結(jié)合物所形成的膠束藥物滲漏率低,并且具有特殊理化性質(zhì)的嵌段或化學(xué)鍵的引入可以賦予膠束獨特的理化性質(zhì),但是共價結(jié)合降低了藥物釋放速率,使其一定時間內(nèi)的累積釋藥量較低,無法達(dá)到理想的治療效果。因此,本研究中,疏水性藥物通過共價結(jié)合和非共價包載兩種方式被封裝在聚合物膠束中,當(dāng)膠束聚集在腫瘤組織中時,此種載藥方式既可以使藥物通過自由擴(kuò)散由膠束釋放到腫瘤組織,快速達(dá)到抑瘤濃度;同時與載體材料結(jié)合的藥物的緩釋或控釋可以使療效得以持續(xù),從而實現(xiàn)高效且長效的腫瘤治療。硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)提取自哺乳動物的軟骨組織,是一種生物源性的強(qiáng)親水性糖胺聚糖,其基本結(jié)構(gòu)單位為D-葡糖醛酸和硫酸化的N-乙酰-D-半乳糖胺通過β-1,3糖苷鍵連接形成的二糖單元,這些重復(fù)的二糖單元通過β-1,4糖苷鍵彼此相連形成具有多種聚合度的的高分子糖鏈。硫酸軟骨素具有較強(qiáng)的生物相容性以及獨特的理化性質(zhì),并且其分子中含有大量的活性基團(tuán),如氨基,羧基等,便于進(jìn)行加工與修飾。因此,硫酸軟骨素及其衍生物被視為一種理想的載體材料。本研究利用疏水性的多烯紫杉醇對水溶性硫酸軟骨素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,制備基于硫酸軟骨素的具有自組裝行為的兩親性載體材料(CS-DTX)。另外,與正常組織相比,腫瘤組織處存在大量的還原性谷胱甘肽(Reductive glutathione,GSH),該物質(zhì)可將分子內(nèi)部的二硫鍵還原為巰基從而斷裂二硫鍵,鑒于此,本研究中將二硫鍵引入膠束體系,制備氧化還原敏感的硫酸軟骨素-多烯紫杉醇結(jié)合物膠束并以此包載多烯紫杉醇原料藥,以提升多烯紫杉醇在水性介質(zhì)中的溶解性及生物利用度,并使多烯紫杉醇濃集在在腫瘤組織,實現(xiàn)高效而持久的腫瘤治療效果,降低毒副作用。本課題的研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面:1.氧化還原敏感的兩親性硫酸軟骨素-多烯紫杉醇結(jié)合物(CS-ss-DTX)的合成,結(jié)構(gòu)表征及自組裝行為考察:合成了含二硫鍵的硫酸軟骨素-胱胺(Cystamine,Cys)結(jié)合物(CS-Cys)與羧基化的多烯紫杉醇(DTX-COOH)并成功將二者連接,制備了含二硫鍵的硫酸軟骨素-多烯紫杉醇結(jié)合物(CS-ss-DTX),利用傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR),質(zhì)譜法(Mass spectrum,MS),核磁共振氫譜法(Hydrogen-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)等評估了中間產(chǎn)物CS-Cys,DTX-COOH以及最終產(chǎn)物CS-ss-DTX的結(jié)構(gòu),證明了目標(biāo)產(chǎn)物的成功合成。通過計算核磁共振氫譜相關(guān)峰峰面積可以求得CS-ss-DTX結(jié)合物中DTX取代度約為11%,為了評估CS-ss-DTX在水溶液中的自組裝行為,利用芘熒光探針法測定了 CS-ss-DTX的臨界膠束濃度值(Critical micelle concentration,CMC),結(jié)果表明 CS-ss-DTX 結(jié)合物 CMC 值較小,為0.040μg/ml。2.包載DTX的氧化還原敏感的CS-ss-DTX膠束的制備及理化性質(zhì)考察:利用透析法成功制備了包載DTX的CS-ss-DTX膠束,利用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)測定了 CS-ss-DTX 膠束中包載的DTX含量,經(jīng)計算可知膠束中DTX總量約為16%,利用透射電鏡法(Transmission electron microscope,TEM)觀察了膠束的外觀形態(tài),利用動態(tài)激光粒度測定儀(Dynamic light scattering,DLS)測定了膠束的粒徑分布以及zeta電位。結(jié)果表明所制得的膠束粒徑分布較均勻,平均粒徑(259.67±2.06)nm,zeta電位(-27±0.43)mV,通過對比膠束在非還原性環(huán)境和還原性環(huán)境中的粒徑分布可以證明所制得的膠束具有氧化還原敏感性。利用透析法分別評估了包載DTX和未包載DTX的CS-ss-DTX膠束在含有還原劑二硫蘇糖醇(D,L-dithiothreitol,DTT)和不含DTT的釋放介質(zhì)中的釋藥行為,結(jié)果表明在兩種釋放介質(zhì)中包載DTX的膠束的累計釋放量均高于未包載DTX的膠束(58.9%vs 26.8%,49.5%vs 19.2%),在含有DTT的釋放介質(zhì)中兩種膠束DTX的累積釋放量均高于不含DTT的釋放介質(zhì)(58.9%vs 49.5%,26.8%vs 19.2%),證明 了包載 DTX 的 CS-ss-DTX 膠束在很長一段時間內(nèi)具有較高的累積釋藥量,并且具有氧化還原敏感的釋藥行為。3.CS-ss-DTX膠束的體外,體內(nèi)抗腫瘤活性研究:利用人乳腺癌細(xì)胞MCF-7評估了 CS-ss-DTX膠束的體外抗腫瘤活性。由于DTX本身不具有熒光,將疏水性的熒光性物質(zhì)香豆素-6(Coumarin-6,C-6)包載入CS-ss-DTX膠束,利用熒光顯微鏡法定性評估膠束的細(xì)胞攝取性能,結(jié)果表明,被MCF-7細(xì)胞所攝取的載C-6的CS-ss-DTX膠束的量高于游離C-6,說明CS-ss-DTX膠束可以聚集于腫瘤組織以充分發(fā)揮抑瘤效果。利用噻唑藍(lán)染色法(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)評估包載DTX的CS-ss-DTX膠束對MCF-7細(xì)胞的毒性,結(jié)果表明,膠束對MCF-7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)高于游離DTX。包載DTX的CS-ss-DTX膠束與MCF-7細(xì)胞系共同培養(yǎng)48h后,利用熒光顯微鏡可以觀察到MCF-7細(xì)胞系的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的破裂,并且細(xì)胞數(shù)目大幅降低,細(xì)胞生長受到抑制。以荷鼠黑色素瘤細(xì)胞B-16的雌性昆明種小鼠為模型動物評估包載DTX的CS-ss-DTX膠束的體內(nèi)抑瘤活性,結(jié)果表明,與多烯紫杉醇溶液相比,載游離DTX的CS-ss-DTX膠束對小鼠黑色素瘤具有較好的抑制作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R943
【圖文】：

２．刺激響應(yīng)的聚合物膠束逡逑聚合物膠束是一種由兩親性聚合物在水性介質(zhì)中自組裝形成的具有核－殼結(jié)逡逑構(gòu)的納米載體（圖１），在水性介質(zhì)中，兩親性載體中疏水性嵌段被水分子排斥逡逑并自發(fā)聚集，形成聚合物膠束的疏水性內(nèi)核，疏水性藥物可以通過與疏水性內(nèi)逡逑＼邐：邐＾邋邋一■邋Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ邋ｓｈｅｌｌ逡逑Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ｄｒｕｇ逡逑ｍｏｌｅｃｕｌｅ逡逑圖１．聚合物膠束的基本結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ逡逑核的非共價相互作用裝載在疏水性內(nèi)核中，兩親性聚合物的親水嵌段可以自發(fā)組逡逑裝形成親水性外殼，從而可以確保其在水性介質(zhì)中的分散性，避免其在循環(huán)過程逡逑中被清除，從而提高了所包載的藥物的半衰期；其納米級的粒徑分布可以使膠束逡逑通過ＥＰＲ效應(yīng)聚集在腫瘤組織中；另外，藥物被包載在聚合物膠束中，由于載逡逑體的保護(hù)，可以提高藥物的穩(wěn)定性；藥物在與載體材料的多種非共價以及共價相逡逑１２逡逑

氧化還原環(huán)境以及酶等和外源性刺激如溫度、外部磁場、光輻射以及超聲等具有逡逑敏感性，具有刺激響應(yīng)的解聚和藥物釋放、能量轉(zhuǎn)換或可監(jiān)測的信號以及活性成逡逑分的產(chǎn)生（圖２）等功能的載化療藥物的刺激響應(yīng)型聚合物膠束是當(dāng)下相關(guān)研究逡逑的熱點。表１概括了典型的幾種可以對內(nèi)、外源性刺激發(fā)生響應(yīng)的載化療藥物逡逑的聚合物膠束［１８＿２９］0逡逑１３逡逑

更強(qiáng)的還原性，由于二硫鍵可以被還原性谷胱甘肽還原為巰基（還原過程如圖逡逑３），因此，在氧化還原敏感納米給藥體系的設(shè)計中，通常通過引入二硫鍵從而賦逡逑予載體氧化還原敏感的特性（圖４）邋［３３＿３６］。逡逑ＨＳ＼逡逑人％丫逡逑ＧＳＨ（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）邐＾逡逑＼邐／邐ＧＳＳＧ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ）逡逑ｚＳ、ｓ＾邐邐邋２邐—ＳＨ逡逑圖３在強(qiáng)還原性環(huán)境下，二硫鍵在還原性谷胱甘肽的作用下斷裂的機(jī)制逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋Ｔｈｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｂｒｅａｋｉｎｇ邋ｏｆ邋ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ邋ｂｏｎｄｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＳＨ逡逑ｉｎ邋ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ｈｉｇｈ邋ｒｅｄｏｘ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑１６逡逑

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