【摘要】：目的:探討烏司他丁對(duì)氧化損傷海馬神經(jīng)元線粒體能量代謝、膜電位變化,以及凋亡相關(guān)蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL-2)、線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCU)的影響和可能的機(jī)制。方法:分離SD胎鼠海馬,采用無(wú)血清培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元,取培養(yǎng)至第9天的神經(jīng)元,采用H2O2建立氧化應(yīng)激損傷模型,分為空白對(duì)照組(N),H2O2組(H),烏司他丁預(yù)處理1000u/ml+H2O2組(UTI1+H),烏司他丁預(yù)處理2000u/ml+H2O2組(UTI2+H),倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)的改變,酶標(biāo)儀檢測(cè)神經(jīng)元的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性;熒光顯微鏡觀察JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化;Annexin-V-Fluorescein/PI雙染法和Hoechst33342/PI雙染法測(cè)神經(jīng)元凋亡率;采用RT-PCR及Western-blot檢測(cè)BCL-2、MCU蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1、采用無(wú)血清培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)8-14天的神經(jīng)元長(zhǎng)勢(shì)最好,細(xì)胞核立體感強(qiáng),軸突聯(lián)接成網(wǎng)絡(luò),神經(jīng)元純度為92.05%,滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。2、各組形態(tài)改變,H組可見(jiàn)神經(jīng)元胞漿濃縮,細(xì)胞核邊集,胞間隙增大,軸突斷裂,少部分細(xì)胞懸浮。UTI1+H和UTI2+H組可見(jiàn)細(xì)胞保持完整形態(tài),部份細(xì)胞皺縮,胞體有光暈。3、ATP酶的測(cè)定:與N組比較,H組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性升高(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響:與N組比較,H組線粒體膜電位降低、凋亡率升高(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組線粒體膜電位升高、凋亡率降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、BCL-2、MCU的表達(dá):與N組比較,H組BCL-2蛋白表達(dá)降低,MCU蛋白表達(dá)增加(P0.05),與H組比較,UTI1+H和UTI2+H組BCL-2蛋白表達(dá)增加,MCU表達(dá)降低(P0.05),UTI1+H和UTI2+H組間BCL-2表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),MCU表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)元可導(dǎo)致能量代謝障礙、線粒體膜電勢(shì)能降低、細(xì)胞凋亡等病理改變。2、經(jīng)過(guò)濃度為1000U/ml、2000U/ml烏司他丁預(yù)處理可以抑制H2O2誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,這可能與其維持細(xì)胞能量代謝、穩(wěn)定線粒體膜電位,升高BCL-2表達(dá),降低MCU表達(dá),從而降低細(xì)胞凋亡率有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96
【圖文】：

9 SD 大鼠孕鼠剖腹取出胎鼠 B：胎鼠 C：體視顯微鏡下未分離海馬組織 D圖 1 胎鼠海馬組織Fig.1 Hippocampus of prenatal rat光學(xué)顯微鏡下海馬神經(jīng)元的形態(tài)變化觀察(圖 2)

注 A：Day1 細(xì)胞基本貼壁，胞體透亮，周?chē)泄鈺灴梢?jiàn)短小突觸 （×100）； B：Day5 細(xì)胞伸出突觸，胞體立體感強(qiáng)（×100）；C:Day8 神經(jīng)元突觸較長(zhǎng)，胞體形圓（×100）；D：Day10 神經(jīng)元交織成網(wǎng)絡(luò)（×100）；E:Day16 神經(jīng)元突起交織成網(wǎng)絡(luò)，胞體相對(duì)變小，光暈減弱（×100）；F：Day20神經(jīng)元折光性弱，細(xì)胞變形，突起連續(xù)性差，部分細(xì)胞開(kāi)始裂解（×100）圖 2 光學(xué)顯微鏡下不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察

- 29 -注 A：Day8 神經(jīng)元免疫熒光，細(xì)胞核 DAPI 標(biāo)記藍(lán)色熒光（×200）；B：Day8 神經(jīng)元，免疫熒光β-Ⅲ Tublin 標(biāo)記胞漿和突觸綠色熒光（×200）；C：merged。圖 3 海馬神經(jīng)元免疫熒光鑒定Fig.3 immune fluorescent identification of hippocampal neurons

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本文編號(hào)：2743250