【摘要】：抗菌藥物在防治細菌感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,也對器官移植、腫瘤化療與放療等新技術(shù)的成功應(yīng)用起著保障作用。然而,細菌耐藥性在全球范圍內(nèi)的廣泛流行和傳播,已對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。特別是腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌等革蘭陰性菌引起的感染,己導(dǎo)致臨床上可選用的有效藥物越來越少。更為嚴重的是,新世紀以來僅有少數(shù)幾個新結(jié)構(gòu)類型的抗菌藥物在全球上市。鑒于此種形勢,世界衛(wèi)生組織(WHO)警告:在不遠的將來,在治療多藥耐藥革蘭陰性菌引起的嚴重感染方面將面臨無藥可用的局面。因此,革蘭陰性菌的多重耐藥性以及耐藥菌引起的感染已成為日益嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題,迫切需要研究全新作用機制的抗菌新藥來應(yīng)對細菌多重耐藥性的挑戰(zhàn)。AcrB是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白,具有高度保守性,能將進入菌體的有害物質(zhì)泵出體外。過度表達AcrB的細菌可將進入菌體內(nèi)的各類藥物分子不斷泵出,使其濃度低于有效濃度,不足以抑制或殺滅細菌,從而導(dǎo)致細菌多藥耐藥表型的產(chǎn)生。如果AcrB的外排機制受到抑制或干擾,將會使得進入菌體內(nèi)的藥物分子不斷積聚,從而恢復(fù)現(xiàn)有抗菌藥物的殺菌效能。因此,AcrB是十分理想的抗菌藥物新靶點。本論文以AcrB為靶標,以課題組前期發(fā)現(xiàn)的AcrB抑制劑NDGA和A3為先導(dǎo)物,根據(jù)靶點的結(jié)構(gòu)性質(zhì),綜合運用藥物化學(xué)原理、計算機輔助藥物設(shè)計和生物化學(xué)等手段,設(shè)計合成三大骨架結(jié)構(gòu)共10個系列化合物。通過逆合成分析,確定了簡潔高效的合成路線,并最終定向合成了 106個目標化合物,并通過多種譜圖對目標化合物的結(jié)構(gòu)進行了表征。在逆轉(zhuǎn)耐藥活性評價方面,我們首先測定目標化合物的固有抗菌活性,確定目標化合物與抗菌劑聯(lián)合用藥時的濃度范圍,以排除聯(lián)合用藥時目標化合物本身對抗菌活性的影響。隨后目標化合物與相應(yīng)抗菌劑(氯霉素、紅霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星)聯(lián)合應(yīng)用測定目標化合物的抗菌增敏活性,然后選取抗菌增敏活性顯著的化合物,通過尼羅紅外排實驗、DiOC2(3)熒光檢測實驗和頭孢硝噻水解實驗進一步測定了它們的外排抑制活性,以及對內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜滲透性的影響,從而在細胞水平上確定它們的靶向性。鄰苯二酚類AcrB抑制劑的研究。本論文第二章以前期發(fā)現(xiàn)的AcrB抑制劑NDGA的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),根據(jù)AcrB結(jié)合位點的具體性質(zhì),通過對右側(cè)苯環(huán)和連接子的結(jié)構(gòu)多樣化修飾,設(shè)計合成了 WA、WB、WC和WD四個系列化合物,并對其進行了體外抗菌增敏活性研究。實驗結(jié)果表明,化合物WA5、WA7、WB11、WD5和WD6表現(xiàn)出較好的抗菌增敏活性,尤其是化合物WD6,在低濃度下(8μg/mL),可提高氯霉素和紅霉素對,E.coli BW25113的敏感性,使他們的活性提高2倍;隨著濃度的升高(32 μg/mL),它的廣譜性逐漸顯現(xiàn),對所有測試抗菌劑都顯示出抗菌增敏活性;而當濃度達到128 μg/mL時,抗菌增敏活性進一步提高,可使氯霉素、紅霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星的抗菌活性分別提高4,4,4和4倍。與對照NDGA相比,這些化合物抗菌增敏活性顯著改善。這些化合物的構(gòu)效關(guān)系總結(jié)如下:(1)鄰苯二酚類化合物的抗菌增敏活性與苯環(huán)上的取代基密切相關(guān),親水性基團為優(yōu)勢基團;(2)在側(cè)鏈末端引入空間位阻較大的芳環(huán)結(jié)構(gòu)如聯(lián)苯、萘和蒽等不利于保持增敏活性;(3中間連接子以三原子鏈為最佳且在連接子中引入酰胺基團能夠顯著提高抗菌增敏活性。為了確認目標化合物的外排抑制活性,我們選取具有抗菌增敏活性的化合物測定了它們對底物尼羅紅的外排抑制活性,并且選取各系列中具有代表性的化合物((WA5、WA7、WA9、WB11、WC1、WC2、WD5和WD6))進一步測定了它們對內(nèi)膜質(zhì)子梯度及外膜滲透性的影響,從而確定其靶向性。實驗結(jié)果表明:化合物WA7、WA9、WA10、WB11、WC3和WC4在100 μM和200μ 濃度下能夠完全抑制尼羅紅的外排作用;化合物WA5、WA7、WA9、WB11和WC2在128和256 μg/mL濃度下不影響細胞外膜滲透性;化合物WA7、WD5和WD6(32 μg/mL)不影響內(nèi)膜質(zhì)子梯度。綜上所述,化合物WA7和WD6是完全意義上的AcrB抑制劑,符合有效AcrB抑制劑的應(yīng)具備的所有條件:(1)對AcrB過表達菌株能增強抗生素的抗菌活性;(2)對AcrB基因缺失菌株無抗菌增敏活性;(3)對AcrB底物尼羅紅具有外排抑制活性;(4)不會破壞細菌外膜的滲透性;(5)不影響內(nèi)膜質(zhì)子梯度。2-萘甲酰胺類AcrB抑制劑的研究。基于AcrB結(jié)合口袋的出口區(qū)域存在一個充滿極性氨基酸和水分子空腔的結(jié)構(gòu),以A3為先導(dǎo)化合物,通過在A3的C-4位側(cè)鏈延伸結(jié)構(gòu)多樣性的極性基團,包括脂肪胺,含極性取代基的芳環(huán)和含氮雜環(huán)等,作為氫鍵受體或供體探索與周圍氨基酸殘基的相互作用以及空間體積的容納性,共設(shè)計合成了 E和F兩個系列共28個化合物。生物活性評價結(jié)果表明,化合物E3、E9、E10、F1、F7、F9和F10表現(xiàn)出一定的抗菌增敏活性,優(yōu)于先導(dǎo)物A3。其中化合物E3和E10(128μg/mL)能夠提高紅霉素的抗菌活性,使其MIC值較單獨使用時降低8倍。此外,化合物E9(256μg/mL)和E10(128μg/mL)能使氯霉素對野生型E.coli BW25113菌株的敏感性提高8和4倍。隨后選取上述具有增敏活性的代表化合物分別測定了它們對尼羅紅的外排抑制活性,以及對內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜滲透性的影響。實驗結(jié)果表明,所有化合物在不同濃度下均表現(xiàn)出一定程度的尼羅紅外排抑制活性,其中化合物E10最為顯著,在100 μM濃度下可以完全抑制尼羅紅的外排;化合物E3、E9、F7和F9對外膜滲透性不會產(chǎn)生影響,而化合物E10、Fl和F10能夠明顯改變頭孢硝噻吩的水解速率,并顯著增加外膜的通透性;化合物E3、E9、E10、F7、F9和F10對內(nèi)膜質(zhì)子梯度沒有影響,而化合物F1能夠破壞內(nèi)膜質(zhì)子梯度,阻遏AcrB的能量來源。綜上所述,化合物E3、E9和F7是完全意義上的AcrB抑制劑。苯并色烯類AcrB抑制劑的研究。在晶體研究和分子模擬研究的基礎(chǔ)上,運用骨架躍遷及片段駢和的藥物設(shè)計原理將2-萘甲酰胺類AcrB-抑制劑的有效藥效團萘環(huán)與吡喃并吡啶環(huán)相結(jié)合得到了一類新穎的苯并[h]色烯母核結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,通過在母核C-5位上引入不同極性的基團以探討與周圍溶劑水分子及氨基酸殘基之間的最佳作用力。同時側(cè)鏈末端苯環(huán)上引入結(jié)構(gòu)多樣的基團以探討它們的構(gòu)效關(guān)系,共設(shè)計合成了 WI-WL四個系列的苯并[h]色烯類化合物�；钚越Y(jié)果顯示,在WJ系列化合物中,化合物WJ10表現(xiàn)出優(yōu)于PAβN的抗菌增敏活性,在濃度為32 μg/mL時即可使氯霉素的MIC值降低2倍;在WK系列化合物中,大部分的化合物(WK1-WK7)都表現(xiàn)出明顯的抗菌增敏活性,尤其是化合物WK2,它在低濃度下對所測試的所有抗菌劑(紅霉素、氯霉素、四苯基氯化膦和左氧氟沙星)都表現(xiàn)出較好的增敏活性,具有一定的廣譜特性;在WL系列化合物中,母核上具有嗎啉甲�；幕衔颳L7和WL10抗菌增敏活性尤為突出,能夠以濃度依賴性的方式(8～128 g/mL)提高相應(yīng)抗菌劑的抗活性,使其MIC降低2～16倍。進一步分析WI-WL四個系列化合物的構(gòu)效關(guān)系可知,在母核苯并[h]色烯母核C-5位上引入不同的取代基對抗菌增敏活性影響顯著,如體積相對較小且與母核存在較強剛性連接的基團更有利于保持抗菌增敏活性;而右側(cè)苯環(huán)上既可以引入體積較大的親水性基團又可以引入體積較小的親脂性基團。隨后選取上述具有增敏活性的代表化合物分別測定了它們對尼羅紅的外排抑制活性,以及對內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜滲透性的影響。實驗結(jié)果表明,化合物WL8和WL9對底物尼羅紅的外排抑制活性最好,在50 μm的濃度下就可以完全抑制尼羅紅的外排;除化合物WL1和WL2在128 μg/mL濃度下對對頭孢噻吩的水解速率產(chǎn)生輕微影響之外,其他化合物(WK1-WK7和WL7-WL10)在128或256μg/mL濃度下并沒有對細胞外膜滲透性產(chǎn)生影響;化合物WK1-WK7、WL2、WL7和WL8不會破壞內(nèi)膜pmf。綜上所述,本論文基于細菌AcrB蛋白復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息,以課題組前期發(fā)現(xiàn)的AcrB抑制劑NDGA和A3為先導(dǎo)化合物,根據(jù)鄰苯二酚類、2-萘甲酰胺類和苯并色烯類AcrB抑制劑各自的結(jié)合模式及藥效團特征,利用骨架躍遷和片段駢和等經(jīng)典藥物原理設(shè)計合成了三大類共106個具有新穎骨架結(jié)構(gòu)的化合物,并對這些化合物依次進行了固有抗菌活性、抗菌增敏活性、尼羅紅外排抑制活性、對內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜滲透性影響的測定,同時運用分子對接軟件進行分子模擬以驗證設(shè)計的合理性。利用得到的構(gòu)效關(guān)系對化合物進行逐步的結(jié)夠改造和優(yōu)化,得到了一些具有高增敏活性和高選擇性的AcrB抑制劑。尤其是化合物WA7和E9,表現(xiàn)出明顯優(yōu)于先導(dǎo)化合物NDGA和A3的抗菌增敏活性,可以完全抑制尼羅紅的外排,抑制率達到100%,而且它們不會破壞內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜滲透性,是完全意義上的AcrB抑制劑。另外,苯并[h]色烯類AcrB抑制劑是我們對此類抑制劑的首次發(fā)現(xiàn),之前未見文獻報道,尤其是化合物WK2、WL7和WL10等均表現(xiàn)出廣譜、高效的抗菌增敏活性,明顯優(yōu)于對照化合物PAβN,這為新型AcrB抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供了新的方向。該研究不僅得到了一些結(jié)構(gòu)新穎且活性較好的先導(dǎo)化合物,而且進一步加深了我們對于AcrB蛋白空間結(jié)構(gòu)的認識,為AcrB抑制劑的合理設(shè)計提供理論依據(jù),為其研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ),為多重耐藥菌的感染治療提供了一條新的思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914
【圖文】：

圖.如吹】

本文編號：2742565