【摘要】：生物毒素具有毒性高、相對穩(wěn)定、難以發(fā)現(xiàn)和核查等特點(diǎn),急需發(fā)展靈敏度高、特異性好和抗干擾能力強(qiáng)的毒素檢測新方法。電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescenc,ECL)傳感器具有靈敏度高、檢測范圍寬、可控性好、響應(yīng)快速、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),特別適用于復(fù)雜物質(zhì)的痕量、超痕量檢測,對于生物毒素的檢測具有極佳的應(yīng)用前景。但是傳統(tǒng)電化學(xué)發(fā)光需要集成式電化學(xué)發(fā)光檢測池,檢測設(shè)備構(gòu)架過大,比較笨重,往往只能在實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院等固定環(huán)境使用,很難便攜應(yīng)用到野外環(huán)境;且使用前后需要仔細(xì)清洗,消耗大量時(shí)間和試劑,若清洗不凈則會給檢測帶來干擾。本研究將電化學(xué)反應(yīng)中心轉(zhuǎn)移到絲網(wǎng)印刷電極(Screen Printed Electrode,SPE)表面,結(jié)合磁分離技術(shù)和噬菌體展示技術(shù),充分利用絲網(wǎng)印刷電極和磁分離免疫檢測的優(yōu)勢,建立了一套靈敏度高、小型便攜、操作簡化的電化學(xué)發(fā)光檢測毒素新方法體系,論文取得了如下成果:1.基于絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)發(fā)光傳感平臺的構(gòu)建和響應(yīng)性能分析。構(gòu)建了基于絲網(wǎng)印刷電極的便攜式電化學(xué)發(fā)光傳感平臺(SPE-ECL傳感器),對絲網(wǎng)印刷電極芯片進(jìn)行表征,并對儀器主要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。該傳感器以絲網(wǎng)印刷電極作為電化學(xué)反應(yīng)中心,取代傳統(tǒng)的分立三電極體系,具有小型便攜、操作簡化的特點(diǎn)。結(jié)果表明,金電極電化學(xué)性能優(yōu)于石墨電極和鉑電極,電極表面金團(tuán)簇分布均勻,有利于磁微球的富集固定和電極表面修飾。優(yōu)化后的傳感器具有良好的檢測穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,可作為后續(xù)毒素檢測的傳感平臺。2.基于標(biāo)記單抗SPE-ECL傳感器檢測毒素研究。利用“生物素-親和素”法在磁微球表面固定多抗作為捕獲探針,以Ru(bpy)32+標(biāo)記單抗作為信號探針,構(gòu)建了SPE-ECL傳感器。該傳感器對相思子毒素(abrin)檢測的線性范圍為0.1 ng/mL～1000 ng/mL,ECL強(qiáng)度(Y)與abrin濃度(X)的關(guān)系滿足線性回歸方程Y=83.6241gX+92.285(R=0.9943,n=8,P0.0001),檢測限為 0.1ng/mL。靈敏度高,線性范圍寬,各組樣品平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)在2.5%～16.5%之間,具有較好的重現(xiàn)性。傳感器能克服非目標(biāo)蛋白和復(fù)雜環(huán)境干擾物對毒素檢測的影響,具有良好的特異性和抗干擾能力�？蓾M足牛奶、土樣、蜂蜜等模擬樣品的分析要求,具有較好的回收率(83.6%～107.0%)。3.基于標(biāo)記噬菌體展示抗體SPE-ECL傳感器檢測毒素研究。以噬菌體展示抗體作為電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記探針,結(jié)合磁分離技術(shù),構(gòu)建了基于SPE-ECL傳感器的生物毒素檢測方法。噬菌體展示抗體的多拷貝衣殼蛋白提供了更多Ru(bpy)32+標(biāo)記位點(diǎn),有效提高了檢測靈敏度。傳感器對abrin檢測的線性范圍為5 pg/mL～500 ng/mL,線性回歸方程為 Y= 1122.5901gX+3235.284(R=0.9969,n=9,P0.0001),檢測限為5 pg/mL,檢測靈敏度比抗體作為標(biāo)記探針時(shí)提高20倍。各組樣品平行測定的RSD值在1.8%～10.8%之間,傳感器具有良好的重現(xiàn)性。傳感器能克服非目標(biāo)蛋白和復(fù)雜環(huán)境干擾物對毒素檢測的影響,具有良好的特異性和抗干擾能力。可滿足牛奶、土樣、蜂蜜等模擬樣品的分析要求,具有較好的回收率(84.3%～104.4%)。4.基于標(biāo)記親合體SPE-ECL傳感器檢測毒素研究。率先在電化學(xué)發(fā)光檢測中應(yīng)用親合體作為特異性識別配體,構(gòu)建了基于SPE-ECL傳感器的生物毒素檢測新方法。傳感器對abrin檢測的線性范圍為5 pg/mL～500 ng/mL,線性回歸方程為Y=1683.838lgX+4495.319(R=0.9963,n=9,P0.0001),檢測限為5 pg/mL,檢測靈敏度與噬菌體展示抗體作為標(biāo)記探針時(shí)相當(dāng),比之抗體提高了 20倍。各組樣品平行測定的RSD值在2.9%～10.4%之間,傳感器具有良好的重現(xiàn)性。傳感器能克服非目標(biāo)蛋白和復(fù)雜環(huán)境干擾物對毒素檢測的影響,具有良好的特異性和抗干擾能力�？蓾M足牛奶、土樣、蜂蜜等模擬樣品的分析要求,具有較好的回收率(85.6%～125.5%)。該傳感器是拓展親合體應(yīng)用方向、豐富ECL傳感體系的一次成功嘗試。本研究將絲網(wǎng)印刷電極高度集成、操作簡化的特點(diǎn)與電化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度高、可控性好、響應(yīng)快速、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)勢結(jié)合起來,分別采用單抗、噬菌體展示抗體、噬菌體展示親合體作為特異性信號探針,建立了基于絲網(wǎng)印刷電極電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測生物毒素的新方法體系,可為為戶外原位環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等領(lǐng)域提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R99;TP212.3
【圖文】：

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文逡逑＝絲網(wǎng)印刷最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是印版的制備，常采用光化學(xué)制版法制版。以絲網(wǎng)為逡逑支撐體，將絲網(wǎng)繃緊在網(wǎng)框上，然后在網(wǎng)上涂布感光膠，形成感光膜，再將底板逡逑密合在版膜上曬版，經(jīng)曝光、顯影，印版上不需要過墨的部分受光固化成膜，將逡逑Ｎ孔封��；印版丨？．網(wǎng)孔不封閉的地方允許油墨透過，在承印物上形成想要的圖案ｍ。逡逑絲Ｎ印刷的工藝流程圖如下所示（圖１．１）：逡逑

１．２．１．４邋金屬配合物（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）逡逑很多金屬配合物都可以發(fā)生ＥＣＬ反應(yīng)，尤其是鑭系元素如釕、錸、鋨等，Ｈ逡逑為其斯諾克躍遷和線忡激發(fā)比較大，擁有很好的發(fā)光潛力，所以成為人們研究的逡逑重點(diǎn)。迎過不斷改變配體進(jìn)行嘗試，人們發(fā)現(xiàn)釕的配合物具有良好的電化學(xué)和發(fā)逡逑光性質(zhì)。１９７２年，Ｂａｒｄ等人首次發(fā)現(xiàn)了邋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的ＥＣＬ現(xiàn)象｜２１１，之后NB做－逡逑系列研究工作，研究ｆＫＥＣＬ機(jī)理和在分析檢測方面的應(yīng)用，并取得了邋？系列成逡逑１？２５１。三（ＴＰＡ）Ｒｕｂ２＋共應(yīng)，Ｓ０２＿、Ｃ0２？經(jīng)逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2724013