發(fā)布時間：2020-06-18 19:21

【摘要】：海洋是一個低溫、高壓、高鹽等復(fù)雜而又特殊的環(huán)境,海洋微生物生存于這樣的環(huán)境中逐步衍生出與陸地生物不同的遺傳基因和代謝機制,造就了其獨特的代謝和防御系統(tǒng)。海洋微生物與海洋海藻、無脊椎動物共附生是一種很普遍的現(xiàn)象,共附生微生物更能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的新穎天然產(chǎn)物。海洋共生曲霉菌是近年來研究最為廣泛的海洋真菌,其次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的化學(xué)多樣性和生物活性,是篩選藥物先導(dǎo)化合物的重要來源之一。曲霉菌次級代謝產(chǎn)物是在一系列相關(guān)酶連續(xù)作用下逐步生成的,這一系列的酶促反應(yīng)組成了代謝途徑,對曲霉菌次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑進行深入研究有利于探究其代謝機理和提高產(chǎn)物產(chǎn)量。論文以濱海植物結(jié)香(Edgeworthia chrysantha Lindl.)來源的一株共生曲霉菌D為研究對象,系統(tǒng)開展了次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇分析、次級代謝產(chǎn)物分離與鑒定、生物活性評價及聚酮類產(chǎn)物生物合成的研究。曲霉菌D經(jīng)馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)培養(yǎng)、固體大米規(guī)模發(fā)酵、乙酸乙酯(EtOAc)超聲萃取后得到粗提物I。采用現(xiàn)代色譜技術(shù)(pre-HPLC、semiprep-HPLC等),對粗提物I進行系統(tǒng)的分離,共得到了8個單體化合物(1 8),利用現(xiàn)代波譜技術(shù)(NMR、MS等)并查閱相關(guān)文獻數(shù)據(jù),鑒定了8個聚酮類單體化合物分別為:rubrofusarin B(1),alternariol 9-O-methyl ether(2),fonsecinone D(3),asperpyrone A(4),asperpyrone D(5),fonsecinone B(6),fonsecinone A(7)和aurasperone A(8)。抑菌活性研究結(jié)果表明,化合物1-8對大腸桿菌(Escherichia coli AB 94012)、白色念珠菌(Candida albicans AY 204006)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus AB 2010021)的抑制作用較弱,MIC值均高于100μg·mL~(-1);僅化合物8對幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)有一定的抑制能力,其MIC值為50μg·mL~(-1)。微生物全基因組測序與結(jié)果分析,表明曲霉菌D具有代謝豐富次級代謝產(chǎn)物的能力。通過antiSMASH預(yù)測菌D中包含11個合成PKS關(guān)鍵基因簇,對其基因簇進行產(chǎn)物結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)菌D具有代謝betaenone類、equisetin類及alternapyrone類化合物的功能。分子生物學(xué)分析結(jié)果表明基因scaffold8.t287可能參與調(diào)控合成聚酮類化合物,經(jīng)抗性標記篩選、重組載體構(gòu)建、根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化等實驗后敲除該目的基因,采用PCR驗證并測序后成功得到敲除菌株?HY44,在相同條件下發(fā)酵菌?HY44得到粗提物II,經(jīng)HPLC制備分離,結(jié)合~1H NMR、UPLC技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲除菌株?HY44的代謝產(chǎn)物種類和含量均發(fā)生了改變,表明該基因確實參與調(diào)控聚酮類化合物的生物合成。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

圖 1-1 Notoamide E4 的生物合成途徑推測Figure 1-1. Plausible biosynthetic pathway of notoamide E41.1.2 曲霉 Aspergillus allahabadii 的研究概述一株香桂來源的植物內(nèi)生真菌 Aspergillus allahabadii BCC45335[3]，經(jīng) PDB 發(fā)酵后，分離得到 2 個新化合物 allahabadolactones A(1.22) 和 B (1.23)，以及 3 個已知的化合物（1.24 1.26）。而后，對化合物 1.22 和 1.23 的生物活性及生物合成途徑進行了研究，如圖 1-2�；钚詫嶒灡砻�，化合物 1.22 1.23 對 Vero 和 NCI-H187 細胞株均有一定細胞毒活性，其 IC50值范圍大約為 0.58-30.51 μg·mL-1。1.22 1.23

圖 1-2 化合物 1.22 1.23 生物合成途徑推測Figure 1-2. Plausible biosynthetic pathway of compounds 1.22 1.23.3 曲霉 Aspergillus europaeus 的研究概述查閱文獻資料報道，大都研究者對曲霉菌來源的次級代謝產(chǎn)物進行抗菌抗腫評價，而關(guān)于抗氧化方面的研究較少�，F(xiàn)有一株海綿 Xestospongia testudinaria 曲霉菌 Aspergillus europaeus WZXY-SX-4-1[4]，基于 OSMAC 策略，對該菌分別、MnPY、ISP2、PDB 液體培養(yǎng)基，及加海鹽的固體大米培養(yǎng)基發(fā)酵，經(jīng) EtOA萃取、初步 DPPH 活性實驗后表明大米發(fā)酵得到的粗提物有顯著的清除自由基活終確定選擇大米作為培養(yǎng)基。結(jié)合硅膠柱和 HPLC 分離，分離得到六個新聚酮物，分別為 eurobenzophenones A-C (1.27 1.29)，euroxanthones A-B (1.30 1.31)，及O-demethylvariecolorquinones A(1.32)，化合物 1.29 對于清除 DPPH 具有較好的活合物 1.28 對于 DPPH 的清除有微弱活性，相應(yīng)的 IC50值分別為 1.70 和 18.5 μg·m 96 孔板 NO 抑制實驗證明，所有化合物均有對小鼠格子細胞 BV2 抑制作用及人腸癌細胞株 SW480 中 NF-κB 激活作用，從而抑制 LPS 誘導(dǎo)一氧化氮（NO）產(chǎn)

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本文編號：2719716