【摘要】：Fc融合蛋白是以人抗體的Fc片段為支架、通過連接肽合理展示具有生物學活性的多肽或功能性蛋白結(jié)構(gòu)域所獲得的新型融合蛋白。Fc融合蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、表達體系、純化工藝以及藥理學研究等方面與抗體藥物類似,也被認為是一種廣義上的抗體類藥物。目前已有11種Fc融合蛋白類藥物獲得FDA批準上市,如依那西普、阿柏西普等。天然PD-1/PD-L1分子間親和力約為10~(-6)M,親和力較低,野生型PD-1或PD-L1不能有效拮抗腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1的結(jié)合,逆轉(zhuǎn)免疫抑制信號。如果對PD-1或PD-L1分子進行特異性的突變改造從而提高其親和力(例如10~(-9)-10~(-10)M),這些突變體就能夠發(fā)揮與抗體類似的阻斷PD-1/PD-L1信號通路的效應(yīng)。而且,改造后的高親和受體/配體結(jié)合表位與天然受體-配體的作用區(qū)域幾乎完全重疊,理論上可以發(fā)揮比抗體更優(yōu)的阻斷效應(yīng)。本論文基于天然PD-1分子的結(jié)構(gòu)特征,借助計算機輔助分子模擬技術(shù)進行PD-1/PD-L1分子結(jié)構(gòu)的模擬和對接,在保證PD-1分子識別PD-L1分子的表位不發(fā)生漂移的前提下,綜合考慮影響蛋白分子成藥性的關(guān)鍵因素(如親和力、穩(wěn)定性等),合理設(shè)計了多個PD-1突變位點,獲得了包括各突變組合的虛擬庫;進一步,借助哺乳動物細胞庫技術(shù)將設(shè)計的突變庫展示于哺乳動物細胞表面,利用流式高通量分選技術(shù)篩選、富集強陽性克隆,實現(xiàn)PD-1分子的體外親和力成熟。同時,建立了PD-1分子體內(nèi)、外評價模型,評價候選分子的生物學活性。具體研究結(jié)果如下:1.PD-1高親和力突變庫的設(shè)計和構(gòu)建借助PD-1、PD-L1晶體結(jié)構(gòu),利用計算機輔助分子模擬、對接技術(shù)合理搭建PD-1/PD-L1相互作用復合物空間結(jié)構(gòu),通過計算機圖形學、距離幾何學以及分子間相互作用模式(分子間氫鍵、Van der Waals作用等)從理論上分析PD-1/PD-L1相互識別的關(guān)鍵氨基酸位點。據(jù)此設(shè)計丙氨酸替換PD-1分子突變體M1-M5,其中M3為對照突變體,經(jīng)實驗確認,理論預(yù)測模型正確,M1、M2、M4、M5為PD-1/PD-L1的主要識別表位。在確認理論作用模型PD-1/PD-L1復合物結(jié)構(gòu)合理的基礎(chǔ)上,考慮分子極性、分子間氫鍵、范德華力等因素進行氨基酸替換,對每一種可能的氨基酸替換進行自由能計算,依照能量越低分子越穩(wěn)定的原理,將自由能低于野生型PD-1分子的氨基酸納入虛擬庫設(shè)計的候選突變位點中并構(gòu)建點突變虛擬庫。利用排列組合原理計算虛擬庫理論庫容量,最終理論庫容為2.98×10~6。2.PD-1高親和力突變體的篩選和初步鑒定(1)基于設(shè)計的點突變虛擬庫設(shè)計兼并引物,合成PD-1突變體分子文庫并克隆至膜展示載體(PFRT-TM),隨機挑取100個克隆進行測序分析,通過多序列比對分析對測序結(jié)果進行質(zhì)量控制,結(jié)果表明在71個測序正確的克隆中所有突變點均為理論設(shè)計的突變點,且氨基酸出現(xiàn)頻率呈均勻分布。同時71個克隆序列多樣性豐富,沒有重復序列,即分子庫的構(gòu)建成功率為71%,符合實驗需求并可用于后續(xù)的細胞庫構(gòu)建。(2)利用實驗室已有的哺乳動物細胞展示系統(tǒng)(FRT定點整合),將PD-1突變體庫質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO-Flp-In細胞,經(jīng)過潮霉素B加壓篩選獲得穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞群,即為哺乳動物細胞PD-1細胞庫。(3)利用流式分選技術(shù)富集陽性高親和細胞,經(jīng)三輪篩選,通過逐步降低PD-L1-biotin濃度的方法(10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL)更好地富集強陽性的細胞群。提取第三輪富集后細胞群的基因組,利用特異性引物進行PCR擴增獲得目的基因。將目的基因克隆入實驗室已有載體PFRT-KIgG1/Fc,經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化,對陽性克隆進行測序,獲得候選分子的序列。(4)將候選分子序列與母本序列進行比對、聚類分析,初步選擇9株代表序列,通過CHO-S表達系統(tǒng)對目的蛋白進行大量表達,純化,獲得胞外段目的蛋白;通過結(jié)合ELISA、競爭ELISA、親和力測定實驗最終獲得一株親和力提高約1000倍的高親和PD-1突變體蛋白,命名為463。3.高親和力PD-1突變體463的生物學活性評價(1)463融合蛋白體外有效結(jié)合PD-L1,發(fā)揮良好的競爭結(jié)合功能:結(jié)合ELISA實驗結(jié)果顯示,463可特異性識別PD-1的配體PD-L1/PD-L2,與野生型PD-1相比,463與PD-L1/PD-L2的結(jié)合活性明顯提高;競爭ELISA實驗結(jié)果顯示,463可有效地競爭阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合,而野生型PD-1則不能有效阻斷。463的阻斷活性較野生型PD-1提高約668倍。(2)463能夠逆轉(zhuǎn)PD-L1誘導的體外T細胞免疫抑制狀態(tài):抗CD3和CD28抗體刺激后T細胞激活,IFN-γ表達上調(diào)。PD-L1能夠抑制T細胞活化,抑制IFN-γ的分泌。463和Opdivo均可以有效阻斷PD-1/PD-L1信號通路,解除T細胞的抑制狀態(tài),恢復IFN-γ的表達,且這一逆轉(zhuǎn)效應(yīng)具有一定的劑量依賴性。(3)463抑制轉(zhuǎn)基因荷瘤小鼠的腫瘤生長:與無關(guān)抗體組相比,10mg/kg 463治療組腫瘤生長抑制率約為72%,2mg/kg治療組為43%,而陽性對照抗體Atezolizumab(10mg/kg)組為77%,10mg/kg野生型PD-1組為14%,提示463的抑瘤效果明顯優(yōu)于野生型PD-1蛋白,與上市抗體藥物有著相似的抑瘤效果。綜上所述,PD-1突變體463具有良好的體內(nèi)、外生物學活性,具有一定的開發(fā)潛力和良好的應(yīng)用前景。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R914
【圖文】：

圖 1 主要上市 PD-1/PD-L1 抗體臨床試驗分類[22]隨著對 PD-1/PD-L1 相互作用模式的不斷深入了解，靶向性的小分子/肽藥物研發(fā)運而生。Aurigene 公司模擬人 PD-1 胞外段氨基酸序列設(shè)計出名為 AUNP-12 的肽衍，通過動物實驗驗證了其抗 PD-L1 的作用和抑瘤效果；此外，可口服的 PD-1 小分制劑也有報道，代號為 CA-170，通過使用間苯二酚和 3-羥基苯硫酚作為母核與 -二甲基氨基甲酸酯和其它烷基取代的胺連接，得到 13 個胺附加的苯基二甲基氨基酯（AAPD）可以與 PD-1 結(jié)合并能夠抑制 PD-1/PD-L1 的相互作用[23]。天然 PD-1/PD子間親和力約為 10-6M[24,25]，野生型的 PD-1 或者 PD-L1 不能作為拮抗分子有效逆瘤微環(huán)境中 PD-1/PD-L1 的抑制信號。如果能夠人為提高 PD-1 或 PD-L1 的親和力（親和力提高至 10-9-10-10M），則高親和受體分子能夠像抗體一樣有效阻斷 PD-1/PD號軸。而且，由于突變體與天然受體-配體作用表位的重疊面更大，理論上具有比更優(yōu)的阻斷效應(yīng)。因此，本論文的研究宗旨是研發(fā)高親和力 PD-1 受體拮抗劑。下詳述本論文的立題依據(jù)和技術(shù)路線。

結(jié) 果2.結(jié) 果D-1 與 PD-L1 相互作用復合物理論空間構(gòu)象機輔助分子模擬技術(shù)、力學優(yōu)化獲得的人 PD-1、PD-L1 空比人 PD-1、PD-L1 晶體結(jié)構(gòu)，PD-1 理論空間結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)SD 值為 0.0026nm，PD-L1 理論空間結(jié)構(gòu)與其晶體結(jié)構(gòu)主鏈為 0.0014nm，提示獲得的理論構(gòu)象結(jié)構(gòu)可信，選擇的力場參

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王師;羅龍龍;呂明;馬遠方;;PD-1/PD-L1信號通路及其在腫瘤中的應(yīng)用[J];國際藥學研究雜志;2015年02期

本文編號：2717761