【摘要】：Fc融合蛋白是以人抗體的Fc片段為支架、通過(guò)連接肽合理展示具有生物學(xué)活性的多肽或功能性蛋白結(jié)構(gòu)域所獲得的新型融合蛋白。Fc融合蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)體系、純化工藝以及藥理學(xué)研究等方面與抗體藥物類(lèi)似,也被認(rèn)為是一種廣義上的抗體類(lèi)藥物。目前已有11種Fc融合蛋白類(lèi)藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市,如依那西普、阿柏西普等。天然PD-1/PD-L1分子間親和力約為10~(-6)M,親和力較低,野生型PD-1或PD-L1不能有效拮抗腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1的結(jié)合,逆轉(zhuǎn)免疫抑制信號(hào)。如果對(duì)PD-1或PD-L1分子進(jìn)行特異性的突變改造從而提高其親和力(例如10~(-9)-10~(-10)M),這些突變體就能夠發(fā)揮與抗體類(lèi)似的阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路的效應(yīng)。而且,改造后的高親和受體/配體結(jié)合表位與天然受體-配體的作用區(qū)域幾乎完全重疊,理論上可以發(fā)揮比抗體更優(yōu)的阻斷效應(yīng)。本論文基于天然PD-1分子的結(jié)構(gòu)特征,借助計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)進(jìn)行PD-1/PD-L1分子結(jié)構(gòu)的模擬和對(duì)接,在保證PD-1分子識(shí)別PD-L1分子的表位不發(fā)生漂移的前提下,綜合考慮影響蛋白分子成藥性的關(guān)鍵因素(如親和力、穩(wěn)定性等),合理設(shè)計(jì)了多個(gè)PD-1突變位點(diǎn),獲得了包括各突變組合的虛擬庫(kù);進(jìn)一步,借助哺乳動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)技術(shù)將設(shè)計(jì)的突變庫(kù)展示于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面,利用流式高通量分選技術(shù)篩選、富集強(qiáng)陽(yáng)性克隆,實(shí)現(xiàn)PD-1分子的體外親和力成熟。同時(shí),建立了PD-1分子體內(nèi)、外評(píng)價(jià)模型,評(píng)價(jià)候選分子的生物學(xué)活性。具體研究結(jié)果如下:1.PD-1高親和力突變庫(kù)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建借助PD-1、PD-L1晶體結(jié)構(gòu),利用計(jì)算機(jī)輔助分子模擬、對(duì)接技術(shù)合理搭建PD-1/PD-L1相互作用復(fù)合物空間結(jié)構(gòu),通過(guò)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)、距離幾何學(xué)以及分子間相互作用模式(分子間氫鍵、Van der Waals作用等)從理論上分析PD-1/PD-L1相互識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。據(jù)此設(shè)計(jì)丙氨酸替換PD-1分子突變體M1-M5,其中M3為對(duì)照突變體,經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn),理論預(yù)測(cè)模型正確,M1、M2、M4、M5為PD-1/PD-L1的主要識(shí)別表位。在確認(rèn)理論作用模型PD-1/PD-L1復(fù)合物結(jié)構(gòu)合理的基礎(chǔ)上,考慮分子極性、分子間氫鍵、范德華力等因素進(jìn)行氨基酸替換,對(duì)每一種可能的氨基酸替換進(jìn)行自由能計(jì)算,依照能量越低分子越穩(wěn)定的原理,將自由能低于野生型PD-1分子的氨基酸納入虛擬庫(kù)設(shè)計(jì)的候選突變位點(diǎn)中并構(gòu)建點(diǎn)突變虛擬庫(kù)。利用排列組合原理計(jì)算虛擬庫(kù)理論庫(kù)容量,最終理論庫(kù)容為2.98×10~6。2.PD-1高親和力突變體的篩選和初步鑒定(1)基于設(shè)計(jì)的點(diǎn)突變虛擬庫(kù)設(shè)計(jì)兼并引物,合成PD-1突變體分子文庫(kù)并克隆至膜展示載體(PFRT-TM),隨機(jī)挑取100個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序分析,通過(guò)多序列比對(duì)分析對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制,結(jié)果表明在71個(gè)測(cè)序正確的克隆中所有突變點(diǎn)均為理論設(shè)計(jì)的突變點(diǎn),且氨基酸出現(xiàn)頻率呈均勻分布。同時(shí)71個(gè)克隆序列多樣性豐富,沒(méi)有重復(fù)序列,即分子庫(kù)的構(gòu)建成功率為71%,符合實(shí)驗(yàn)需求并可用于后續(xù)的細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建。(2)利用實(shí)驗(yàn)室已有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示系統(tǒng)(FRT定點(diǎn)整合),將PD-1突變體庫(kù)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至CHO-Flp-In細(xì)胞,經(jīng)過(guò)潮霉素B加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞群,即為哺乳動(dòng)物細(xì)胞PD-1細(xì)胞庫(kù)。(3)利用流式分選技術(shù)富集陽(yáng)性高親和細(xì)胞,經(jīng)三輪篩選,通過(guò)逐步降低PD-L1-biotin濃度的方法(10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL)更好地富集強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞群。提取第三輪富集后細(xì)胞群的基因組,利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的基因。將目的基因克隆入實(shí)驗(yàn)室已有載體PFRT-KIgG1/Fc,經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化,對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲得候選分子的序列。(4)將候選分子序列與母本序列進(jìn)行比對(duì)、聚類(lèi)分析,初步選擇9株代表序列,通過(guò)CHO-S表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá),純化,獲得胞外段目的蛋白;通過(guò)結(jié)合ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、親和力測(cè)定實(shí)驗(yàn)最終獲得一株親和力提高約1000倍的高親和PD-1突變體蛋白,命名為463。3.高親和力PD-1突變體463的生物學(xué)活性評(píng)價(jià)(1)463融合蛋白體外有效結(jié)合PD-L1,發(fā)揮良好的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合功能:結(jié)合ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,463可特異性識(shí)別PD-1的配體PD-L1/PD-L2,與野生型PD-1相比,463與PD-L1/PD-L2的結(jié)合活性明顯提高;競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,463可有效地競(jìng)爭(zhēng)阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合,而野生型PD-1則不能有效阻斷。463的阻斷活性較野生型PD-1提高約668倍。(2)463能夠逆轉(zhuǎn)PD-L1誘導(dǎo)的體外T細(xì)胞免疫抑制狀態(tài):抗CD3和CD28抗體刺激后T細(xì)胞激活,IFN-γ表達(dá)上調(diào)。PD-L1能夠抑制T細(xì)胞活化,抑制IFN-γ的分泌。463和Opdivo均可以有效阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路,解除T細(xì)胞的抑制狀態(tài),恢復(fù)IFN-γ的表達(dá),且這一逆轉(zhuǎn)效應(yīng)具有一定的劑量依賴(lài)性。(3)463抑制轉(zhuǎn)基因荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng):與無(wú)關(guān)抗體組相比,10mg/kg 463治療組腫瘤生長(zhǎng)抑制率約為72%,2mg/kg治療組為43%,而陽(yáng)性對(duì)照抗體Atezolizumab(10mg/kg)組為77%,10mg/kg野生型PD-1組為14%,提示463的抑瘤效果明顯優(yōu)于野生型PD-1蛋白,與上市抗體藥物有著相似的抑瘤效果。綜上所述,PD-1突變體463具有良好的體內(nèi)、外生物學(xué)活性,具有一定的開(kāi)發(fā)潛力和良好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R914
【圖文】：

圖 1 主要上市 PD-1/PD-L1 抗體臨床試驗(yàn)分類(lèi)[22]隨著對(duì) PD-1/PD-L1 相互作用模式的不斷深入了解，靶向性的小分子/肽藥物研發(fā)運(yùn)而生。Aurigene 公司模擬人 PD-1 胞外段氨基酸序列設(shè)計(jì)出名為 AUNP-12 的肽衍，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其抗 PD-L1 的作用和抑瘤效果；此外，可口服的 PD-1 小分制劑也有報(bào)道，代號(hào)為 CA-170，通過(guò)使用間苯二酚和 3-羥基苯硫酚作為母核與 -二甲基氨基甲酸酯和其它烷基取代的胺連接，得到 13 個(gè)胺附加的苯基二甲基氨基酯（AAPD）可以與 PD-1 結(jié)合并能夠抑制 PD-1/PD-L1 的相互作用[23]。天然 PD-1/PD子間親和力約為 10-6M[24,25]，野生型的 PD-1 或者 PD-L1 不能作為拮抗分子有效逆瘤微環(huán)境中 PD-1/PD-L1 的抑制信號(hào)。如果能夠人為提高 PD-1 或 PD-L1 的親和力（親和力提高至 10-9-10-10M），則高親和受體分子能夠像抗體一樣有效阻斷 PD-1/PD號(hào)軸。而且，由于突變體與天然受體-配體作用表位的重疊面更大，理論上具有比更優(yōu)的阻斷效應(yīng)。因此，本論文的研究宗旨是研發(fā)高親和力 PD-1 受體拮抗劑。下詳述本論文的立題依據(jù)和技術(shù)路線(xiàn)。

結(jié) 果2.結(jié) 果D-1 與 PD-L1 相互作用復(fù)合物理論空間構(gòu)象機(jī)輔助分子模擬技術(shù)、力學(xué)優(yōu)化獲得的人 PD-1、PD-L1 空比人 PD-1、PD-L1 晶體結(jié)構(gòu)，PD-1 理論空間結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)SD 值為 0.0026nm，PD-L1 理論空間結(jié)構(gòu)與其晶體結(jié)構(gòu)主鏈為 0.0014nm，提示獲得的理論構(gòu)象結(jié)構(gòu)可信，選擇的力場(chǎng)參

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王師;羅龍龍;呂明;馬遠(yuǎn)方;;PD-1/PD-L1信號(hào)通路及其在腫瘤中的應(yīng)用[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2015年02期

本文編號(hào)：2717761