【摘要】：重金屬鉛的污染影響著食品品質(zhì)和安全,危害人體健康。鉛對機(jī)體多個器官都會產(chǎn)生毒性,而其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為敏感。近年來國內(nèi)外對鉛神經(jīng)毒性機(jī)制的研究取得了一系列的進(jìn)展,然而表觀遺傳調(diào)控在鉛神經(jīng)毒性中的作用仍不是很清楚。目的:探究組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)在鉛導(dǎo)致的神經(jīng)毒性中的作用機(jī)制,為鉛中毒防治提供一個有力的效應(yīng)因子。方法與結(jié)果:1.研究HDAC4參與鉛引起的神經(jīng)毒性作用過程。以PC12細(xì)胞作為研究對象,采用10μM的鉛處理24 h,通過q-PCR以及western blot檢測HDAC4 mRNA以及蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鉛暴露后HDAC4 mRNA以及蛋白水平均表現(xiàn)出異常提升的現(xiàn)象。母鼠從孕期開始飲用含有鉛(250 ppm)的水,對其子代(21 d)海馬中HDAC4 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體內(nèi)鉛暴露后HDAC4的表達(dá)與細(xì)胞上的結(jié)果一致。通過添加HDAC4抑制劑(LMK-235)以及基因手段干擾RNA(shHDAC4)觀察PC12細(xì)胞突起生長情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LMK-235及敲低HDAC4能夠修復(fù)鉛引起的細(xì)胞突起損傷,說明HDAC4參與調(diào)控鉛神經(jīng)毒性的過程。2.探究HDAC4核內(nèi)堆積參與鉛神經(jīng)毒性過程及其核內(nèi)堆積的上游因子。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察鉛對HDAC4亞細(xì)胞分布的影響和分別提取細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白檢測HDAC4的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉛暴露可導(dǎo)致HDAC4在細(xì)胞核內(nèi)堆積。構(gòu)建核定位信號缺失的HDAC4質(zhì)粒(ΔNLS2-HDAC4)轉(zhuǎn)染觀察細(xì)胞突起生長,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阻斷HDAC4的進(jìn)核過程可以回復(fù)鉛引起的細(xì)胞突起損傷,說明HDAC4的細(xì)胞核部分在鉛暴露后發(fā)揮著不良作用。為探究調(diào)控HDAC4核內(nèi)堆積的上游因子,接下來檢測鉛作用下磷酸酶PP1、PP2A以及激酶CaMK mRNA的表達(dá)水平,q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鉛暴露后引起細(xì)胞內(nèi)PP1和PP2A表達(dá)水平的提高,而CaMK表達(dá)減少�；蚯玫蚉P1檢測HDAC4的亞細(xì)胞分布及觀測細(xì)胞突起生長情況,實(shí)驗(yàn)表明PP1敲低后能夠?qū)€U作用下核內(nèi)堆積的HDAC4重新再分布到細(xì)胞質(zhì)中,而鉛暴露下轉(zhuǎn)染shPP1建立損傷修復(fù)再損傷實(shí)驗(yàn)觀測到細(xì)胞突起生長出現(xiàn)缺陷,則說明鉛暴露通過上調(diào)PP1的表達(dá),介導(dǎo)HDAC4進(jìn)入細(xì)胞核的過程,進(jìn)而調(diào)控鉛的神經(jīng)毒性過程。3.探究鉛暴露影響HDAC4的共同作用分子EZH2。LMK-235處理檢測胞核與胞質(zhì)蛋白中HDAC4的表達(dá),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LMK-235能夠回復(fù)鉛暴露后PP1的表達(dá)水平同時(shí)也能夠?qū)€U暴露后核內(nèi)的HDAC4再分布至細(xì)胞質(zhì)中。同時(shí)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測LMK-235處理后HDAC4的亞細(xì)胞分布及其與EZH2的共定位情況,發(fā)現(xiàn)抑制劑LMK-235能夠重新分布鉛作用下核內(nèi)堆積的HDAC4至細(xì)胞質(zhì),且EZH2與HDAC4在細(xì)胞中能夠共定位。蛋白提取過程中添加NEM(N-乙基馬來酰胺)和使用類泛素化檢測試劑盒檢測EZH2的類泛素化水平,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉛能夠增加EZH2與HDAC4之間的相互作用和EZH2的類泛素化水平,而LMK-235與ΔNLS2-HDAC4質(zhì)粒能夠回復(fù)這種變化。結(jié)論:HDAC4在調(diào)節(jié)鉛暴露引起的神經(jīng)毒性方面發(fā)揮了重要作用,且由磷酸酶PP1介導(dǎo)的HDAC4核內(nèi)堆積被認(rèn)為是鉛作用下神經(jīng)細(xì)胞中的一個關(guān)鍵分子過程。同時(shí)HDAC4的異常提升增強(qiáng)了它與一個新的功能伙伴——EZH2的相互作用,首次發(fā)現(xiàn)HDAC4促進(jìn)了EZH2的類泛素化過程,且發(fā)現(xiàn)了一條從PP1-HDAC4-EZH2的新路徑來闡述鉛的神經(jīng)毒性。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.6;R99
【圖文】：

圖 2.1 體內(nèi)體外鉛暴露對 HDAC4 基因表達(dá)的影響Fig 2.1 Relative mRNA level of HDAC4 in vivo and vitro exposed by Pb2.4.1.2 鉛暴露異常提升 HDAC4 蛋白的表達(dá)水平之前的數(shù)據(jù)表明鉛暴露能夠異常提升 HDAC4 的 mRNA 表達(dá)水平，所以接下來我們來探究鉛暴露下 HDAC4 的蛋白水平變化。如圖 2.2（A）PC12 細(xì)胞鉛暴露導(dǎo)致 HDAC4 蛋白異常積累，與此同時(shí)在長期慢性鉛暴露的 SD 大鼠海馬中，HDAC4 的蛋白表達(dá)量也顯著升高（B），表明 HDAC4 的異常積累與鉛所致的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙存在關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)表明 HDAC4 可能是導(dǎo)致鉛神經(jīng)毒性的一個因子。A BHDAC4β-actinCtrl PbHDAC4β-actinCtrl Pb

圖 2.1 體內(nèi)體外鉛暴露對 HDAC4 基因表達(dá)的影響Fig 2.1 Relative mRNA level of HDAC4 in vivo and vitro exposed by Pb2.4.1.2 鉛暴露異常提升 HDAC4 蛋白的表達(dá)水平之前的數(shù)據(jù)表明鉛暴露能夠異常提升 HDAC4 的 mRNA 表達(dá)水平，所以接下來我們來探究鉛暴露下 HDAC4 的蛋白水平變化。如圖 2.2（A）PC12 細(xì)胞鉛暴露導(dǎo)致 HDAC4 蛋白異常積累，與此同時(shí)在長期慢性鉛暴露的 SD 大鼠海馬中，HDAC4 的蛋白表達(dá)量也顯著升高（B），表明 HDAC4 的異常積累與鉛所致的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙存在關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)表明 HDAC4 可能是導(dǎo)致鉛神經(jīng)毒性的一個因子。A BCtrl PbCtrl Pb

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2717160