【摘要】：目的:設計合成一系列2,4-二芳基嘧啶類布魯頓氏酪氨酸蛋白激酶(BTK)抑制劑,通過初步評價其對慢性B淋巴細胞白血病的抗腫瘤活性,以篩出活性更好、毒性更低更加優(yōu)良的化合物。方法:本論文的第一部分以BTK抑制劑Spebrutinib為先導化合物,基于分子雜合策略,在其二苯胺基嘧啶骨架的C-2位引入氨基片段,制備一系列新型的2,4-二芳基嘧啶類小分子化合物,共計12個新型化合物;并借助~1HNMR、~(13)CNMR、HRMS、MS對目標分子進行結構鑒定。第二部分以Spebrutinib和Ibrutinib作為陽性對照藥,在激酶水平上,通過定量分析酶促反應后剩余的ATP含量來測定BTK酪氨酸激酶半數抑制率(IC_(50));在體外腫瘤細胞篩選中,采用CCK-8比色法,選取BTK高表達的人源B淋巴瘤細胞Ramos和Raji,測定了目標分子在48 h作用下對腫瘤細胞的抑制率IC_(50)值;并采用AO/EB雙染法進行染色,考察最優(yōu)的化合物對腫瘤細胞Ramos的抑制效果;提取正常外周血單個核細胞(PBMC),檢測最優(yōu)化合物對正常免疫細胞的毒性作用;以流式細胞術考察最優(yōu)化合物對B淋巴瘤細胞的凋亡作用以及對細胞周期的作用機制。結果:第一部分合成純化獲得12個目標分子,并且核磁數據與目標分子結構特征一致,高分辨質譜特征與目標分子分子質量一致。第二部分化合物初步活性測試結果顯示,合成的目標分子大多具有良好的抗腫瘤活性,其中D12具有較優(yōu)的抑制BTK激酶活性,IC_(50)為0.23nM;同時,化合物D10對Ramos細胞和Raji細胞具有很好的活性,IC_(50)分別為10.5μM、19.1μM;AO/EB熒光染色結果顯示,與空白組相比,給予化合物D10處理后腫瘤細胞數目明顯減少,出現(xiàn)凋亡,細胞核發(fā)生固縮;毒性試驗中,最優(yōu)化合物D10對正常外周血單個核細胞(PBMC)幾乎沒有毒性作用;流式細胞術考察最優(yōu)化合物D10對B淋巴瘤細胞Ramos的凋亡具有顯著的提高,同時將細胞周期抑制了在G0/G1階段。結論:本研究成功合成得到嘧啶類衍生物;抗腫瘤藥理活性初步研究揭示大多數合成化合物具有較強的抑制腫瘤細胞增殖的活性,部分化合物如D10的抑制BTK激酶活性及抑制腫瘤細胞活性要優(yōu)于陽性對照化合物Spebrutinib,可以作為候選化合物進行更進一步的開發(fā)。本文的結構修飾表明:對二苯胺基嘧啶骨架左側氨基側鏈進行結構優(yōu)化能有效改善藥物抗腫瘤活性及毒性,為此類分子的結構優(yōu)化提供構效關系理論基礎。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R943;R96
【圖文】：

圖 3 Spebrutinib 與 BTK 作用示意圖(PDB: 3GEN)結合 Spebrutinib 的合成方法[17]，通過查閱文獻及本實驗室早期實驗基礎計了下面的合成路線：母核NClN ClR1NClN NHNHOR1NH2NHONO2NHONO2NH2a bc1 2 4a-b3R1= Cl, FR2= H, Cl, MeO

圖 11 化合物 D10 作用于 Ramos 細胞的 AO/EB 染色實驗（10 ×）3.5 流式細胞儀檢測3.5.1 凋亡分析本實驗中應用流式細胞凋亡法考察最優(yōu)化合物 D10（20 μM、10 μM 和 5 μM）對 Ramos 細胞處理 48 后對 Ramos 細胞增殖的影響。從圖 12 可以看出，在 5 μM、10 μM 、20 μM 時凋亡率達到 38.0%, 46.8% 和 83.6%，與空白組呈顯著差異，濃度依賴性升高。且從柱形圖中可以看出 10 μM 時 D10 與對照藥 Spebrutinib 有顯著學差異，與 Iburtinib 無顯著學差異，達到了很好的抑制增殖的效果。

【參考文獻】

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本文編號：2715253