【摘要】：腫瘤是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病,迄今為止,化療仍是惡性腫瘤的主要治療方式,但傳統(tǒng)的化療藥物靶向性差、毒副作用大、順應(yīng)性差、治療效果不佳。近年來(lái),納米藥物遞送系統(tǒng)特別是響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)在一定程度上克服了化療的弊端,而受到人們的普遍關(guān)注。但多數(shù)刺激響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)目前主要針對(duì)腫瘤微環(huán)境,如低pH、高谷胱甘肽(Glutathione,GSH),而炎癥也具有類似的環(huán)境,因此缺乏腫瘤組織特異性。因此,為提高響應(yīng)特異性,一些研究利用超聲、光照等外源性刺激,響應(yīng)治療腫瘤,但因體外刺激的光和超聲波在體內(nèi)呈指數(shù)級(jí)別衰減,因此響應(yīng)靈敏度有限�；谏鲜龇治�,如何構(gòu)建出能夠特異并靈敏地響應(yīng)腫瘤細(xì)胞特異分子(腫瘤標(biāo)志物)來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異、靈敏的藥物釋放,實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞激活治療是響應(yīng)型藥物遞送系統(tǒng)亟待解決的問(wèn)題�；诖�,本課題擬構(gòu)建一種磁性復(fù)合納米粒,通過(guò)腫瘤標(biāo)志物響應(yīng)性的修飾,將磁靶向性與靈敏響應(yīng)腫瘤細(xì)胞的控釋系統(tǒng)相結(jié)合,在腫瘤部位外加磁場(chǎng)作用下,可將藥物快速遞送至腫瘤組織并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性釋放藥物,從而達(dá)到提高治療效果,降低毒副作用的目的。該藥物遞送系統(tǒng)主要通過(guò)三方面來(lái)實(shí)現(xiàn)以上目標(biāo),1.介孔門(mén)控為腫瘤細(xì)胞激活響應(yīng)治療提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);2.DNA堿基互補(bǔ)及其識(shí)別目標(biāo)分子后的構(gòu)象變化特征為腫瘤細(xì)胞激活響應(yīng)治療提供“智能”感應(yīng)門(mén)控;3.磁靶向特征為系統(tǒng)順利、高效到達(dá)腫瘤組織奠定基礎(chǔ)。氧化鐵納米粒(Iron Oxide Nanoparticles,IONPs)具有超順磁性,磁響應(yīng)能力強(qiáng),可磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)等特點(diǎn)。介孔二氧化硅納米粒(Mesoporous Silica Nanoparticles,MSNs)作為遞送系統(tǒng)的藥物儲(chǔ)庫(kù)具有諸多優(yōu)點(diǎn),如:比表面積大、生物相容性好、毒性低、孔徑可調(diào)、表面易于修飾等。本課題首先通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成IONP,再以IONP為核,通過(guò)溶膠-凝膠法制備核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒(IONP@MSN,核:IONP,殼:MSN),隨后對(duì)其表面進(jìn)行疊氮官能團(tuán)修飾(IONP@MSN-N3),利用其孔道裝載廣譜化療藥物阿霉素(Doxorubicin,DOX),最終通過(guò)環(huán)加成反應(yīng)在載藥的IONP@MSN-N3表面連接可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物mi RNA-21且尾部有炔基修飾的發(fā)卡狀DNA。該發(fā)卡狀DNA不僅可以作為門(mén)控分子,避免DOX提前泄漏,而且該發(fā)卡狀DNA的頭部序列與miRNA-21完全互補(bǔ),能夠通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與腫瘤細(xì)胞內(nèi)mi RNA-21快速、高效識(shí)別并形成雙鏈結(jié)構(gòu),導(dǎo)致發(fā)卡狀DNA發(fā)生構(gòu)象變化,由發(fā)卡狀構(gòu)象變?yōu)橹辨湗?gòu)象,孔道開(kāi)啟,實(shí)現(xiàn)高效、快速的藥物釋放。通過(guò)上述制備過(guò)程最終制備出具有腫瘤細(xì)胞特異觸發(fā)-激活治療能力的磁靶向藥物遞送系統(tǒng)IONP@MSN/DOX-DNA。本課題利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FT-IR)、X射線衍射測(cè)試(X-ray Diffraction,XRD)、能譜分析(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)等表征手段來(lái)證明IONP、IONP@MSN以及IONP@MSN-N_3的成功制備,傅里葉紅外光譜(FT-IR)圖和紫外全波長(zhǎng)掃描圖結(jié)果表明發(fā)卡狀DNA成功連接在IONP@MSN-N_3表面,證明IONP@MSN-DNA的成功制備。透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)掃描圖表明我們制備的IONP@MSN-N_3粒徑大小約為150 nm,具有核殼結(jié)構(gòu)。通過(guò)氮?dú)馕矫摳綄?shí)驗(yàn),得到IONP@MSN-N_3納米粒的比表面積為767.1698 m2/g,孔體積為1.03 cm~3/g,納米粒子的平均孔道直徑為3.04 nm,孔徑大小適合藥物裝載。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度法載藥率的測(cè)定,證明納米載體IONP@MSN-N_3成功并高效裝載DOX,成功制備出IONP@MSN/DOX-DNA,載藥率高達(dá)89.4%,并且在miRNA-21存在下,藥物大量釋放,48 h的釋藥率約為65.7%,而對(duì)照組48 h的釋藥率僅為11%。TEM掃描圖表明其粒徑大小約170 nm,而且磁性測(cè)試結(jié)果表明其具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)能力。本課題以人肝癌細(xì)胞(HepG2)為模型細(xì)胞,以人肝正常細(xì)胞(HL-7702)為對(duì)照細(xì)胞,考察腫瘤細(xì)胞激活式藥物遞送系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性。RT-PCR對(duì)兩種細(xì)胞的miRNA-21表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明HepG2的miRNA-21表達(dá)量是HL-7702的3.57倍,具有顯著差異。從激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)拍攝的8 h內(nèi)相同量的IONP@MSN/DOX-DNA在兩種細(xì)胞內(nèi)DOX的釋放結(jié)果發(fā)現(xiàn),藥物DOX僅在HepG2細(xì)胞中大量釋放,在HL-7702細(xì)胞中釋放較少,這說(shuō)明腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的miRNA-21具有激活DOX釋放的能力。IONP@MSN/DOX-DNA(DOX:20μg/mL)對(duì)HepG2細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞的24 h抑制率分別為68.7%和25.2%,凋亡率分別為58.5%和18.01%,表明該納米系統(tǒng)的治療具有顯著的選擇性。此外,隨機(jī)序列DNA*(對(duì)miRNA-21無(wú)識(shí)別作用)堵孔的IONP@MSN/DOX-DNA*對(duì)兩種細(xì)胞均無(wú)顯著的殺傷作用,其對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡率為14.74%,對(duì)HL-7702細(xì)胞的凋亡率為12.2%。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明制備的IONP@MSN/DOX-DNA具有腫瘤細(xì)胞激活治療能力,降低對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。本課題以HepG2細(xì)胞荷瘤裸鼠為動(dòng)物模型,考察腫瘤細(xì)胞激活式藥物遞送系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過(guò)活體成像技術(shù)考察IONP@MSN/IR783-DNA在裸鼠體內(nèi)的分布情況,結(jié)果顯示,與游離IR783組相比,IONP@MSN/IR783-DNA組增加IR783的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,具有被動(dòng)靶向作用,更重要的是在磁場(chǎng)的作用下,其具有顯著的磁靶向能力。藥效學(xué)結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)兩周治療,制劑IONP@MSN/DOX-DNA組對(duì)腫瘤的抑制率為72.4%,腫瘤部位給予外加磁場(chǎng)的IONP@MSN/DOX-DNA+MF組對(duì)腫瘤的抑制率為84.2%,而IONP@MSN/DOX-DNA*組無(wú)明顯治療作用,說(shuō)明構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞激活式藥物遞送系統(tǒng)對(duì)腫瘤具有顯著的治療作用。病理學(xué)分析進(jìn)一步證實(shí)了IONP@MSN/DOX-DNA具有良好的抗腫瘤效果,并顯著降低DOX對(duì)正常組織的毒副作用。裸鼠磁共振成像結(jié)果顯示,載體IONP@MSN-DNA具有良好的磁共振成像能力。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943
【圖文】：

6圖 1.1 IONP@MSN/DOX-DNA 治療腫瘤細(xì)胞的示意圖Figure 1.1 Concepts of the tumor cell activated therapy using IONP@MSN/DOX-DNA

對(duì) DOX 和發(fā)卡狀 DNA 在 200~800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖2.1 所示。DOX 在 480 nm 處有個(gè)特征吸收峰，且無(wú)雜質(zhì)峰干擾，在 240 nm 處雖然有最大吸收峰，但溶劑在此處的吸收容易產(chǎn)生干擾。發(fā)卡狀 DNA 在 260 nm處有一個(gè)特征吸收峰，在 480 nm 處無(wú)吸收峰出現(xiàn)，不會(huì)對(duì) DOX 的檢測(cè)造成干擾，故可以選用 480 nm 作為 DOX 的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

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本文編號(hào)：2714900