【摘要】：目的探究p53依賴途徑是否參與調(diào)控微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)SD大鼠睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程,線粒體在發(fā)生凋亡過程中又發(fā)揮怎樣的作用?通過檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中線粒體膜電位、p53依賴途徑凋亡相關(guān)蛋白及線粒體外膜蛋白VDAC1等,驗(yàn)證p53依賴途徑及線粒體在微囊藻毒素-LR誘發(fā)SD大鼠睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程中的作用,為微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)的生殖毒性提供新的分子機(jī)制和理論基礎(chǔ)。方法1.原代睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞提取和培養(yǎng):選取22天SD雄鼠,分離睪丸,提取睪丸支持-生精細(xì)胞,建立睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞體系。2.細(xì)胞增殖抑制率檢測:不同濃度MC-LR(0,1,5,10,20,40,60μg/mL)染毒睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,采用CCK-8試劑盒測定各濃度組細(xì)胞增殖抑制情況,并計(jì)算出MC-LR作用于睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24 h半數(shù)抑制濃度IC_(50),選取實(shí)驗(yàn)所用濃度為IC_(50)、1/2IC_(50)及1/4IC_(50)。3.細(xì)胞凋亡率測定:采用AnnexinV-FITC/PI染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測各濃度MC-LR組及MC-LR+相應(yīng)抑制劑(PFT-α和CsA)組睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡率變化。4.細(xì)胞線粒體膜電位檢測:各濃度MC-LR組及MC-LR+相應(yīng)抑制劑(PFT-α和CsA)組染毒睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,JC-1法結(jié)合流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞線粒體膜電位有何變化。5.分離提取細(xì)胞中線粒體:各濃度MC-LR組及MC-LR+相應(yīng)抑制劑(PFT-α和CsA)組作用睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,采用線粒體分離試劑盒分離睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞中線粒體,用于下一步提取線粒體和細(xì)胞漿蛋白。6.凋亡相關(guān)蛋白檢測:Western blotting法檢測各濃度MC-LR組及MC-LR+相應(yīng)抑制劑(PFT-α和CsA)組睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞中p53、PUMA、p21、MDM2及Cytc等蛋白相對表達(dá)水平。7.VDAC1 mRNA水平測定:采用Real time-PCR檢測各濃度MC-LR組及MC-LR+CsA組睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞中VDAC1在mRNA水平相對表達(dá)量。結(jié)果1.MC-LR染毒睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24 h后,除1μg/mL濃度組,MC-LR均能抑制睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞增殖。MC-LR濃度越大,對睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞增殖越明顯,與對照組相比,差異具有顯著性(P0.05)。經(jīng)計(jì)算,MC-LR作用于睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞IC_(50)為36μg/mL,所選實(shí)驗(yàn)濃度分別為36μg/mL、18μg/mL和9μg/mL。2.不同濃度MC-LR(0,9,18,36μg/mL)作用睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24h后,均可誘導(dǎo)睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MC-LR濃度越大,細(xì)胞凋亡率越高。在36μg/mL濃度組預(yù)先2 h進(jìn)行PFT-α或CsA處理后,細(xì)胞凋亡率與單獨(dú)36μg/mL MC-LR組相比,有明顯降低,差異具有顯著性(P0.05)。3.不同濃度MC-LR(0,9,18,36μg/mL)染毒睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24h后,與對照組相比,可明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位水平(P0.05),隨MC-LR濃度增加,線粒體膜電位下降越明顯。在36μg/mL濃度組提前2 h進(jìn)行PFT-α或CsA預(yù)處理后,細(xì)胞線粒體膜電位水平與單獨(dú)36μg/mL MC-LR組相比,有明顯升高,差異具有顯著性(P0.05)。4.不同濃度MC-LR(0,9,18,36μg/mL)作用睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24h后,可顯著促進(jìn)p53依賴途徑促凋亡蛋白p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3相對表達(dá)水平,降低MDM2蛋白表達(dá)水平,與對照組相比,差異具有顯著性(P0.05)。在36μg/mL濃度組提前2 h進(jìn)行PFT-α預(yù)處理,與單獨(dú)36μg/mL MC-LR組相比,可明顯抑制p53、PUMA、P21、clevead PARP及clevead caspase-3的蛋白相對表達(dá),同時(shí)抑制Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。5.不同濃度MC-LR(0,9,18,36μg/mL)染毒睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞24h后,可明顯上調(diào)線粒體外膜蛋白VDAC1在蛋白和mRNA表達(dá)水平(P0.05)。在36μg/mL濃度組提前2 h進(jìn)行CsA預(yù)處理,與單獨(dú)36μg/mL MC-LR組相比,可顯著抑制Cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)(P0.05),但對VDAC1蛋白相對表達(dá)無明顯抑制作用。結(jié)論1.p53依賴途徑介導(dǎo)MC-LR致大鼠睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程2.MC-LR誘導(dǎo)大鼠睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞mPTP開放,促進(jìn)Cyt c釋放3.細(xì)胞周期阻滯可能參與了大鼠睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R99
【圖文】：

MC-LR對睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞增殖抑制的影響

MC-LR引起睪丸支持-生精共培養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加注：A.0μg/mL,B.9μg/mL,C.18μg/mL,D.36μg/mL

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 王曉龍;段蕾;閻智偉;賈茹;邢云鵬;牛僑;聶繼盛;;苯并[a]芘通過P53/PUMA通路介導(dǎo)大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡研究[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2015年02期

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本文編號：2713352