【摘要】：基因遞送過程中遇到的多重生理屏障在很大程度上影響了基因治療的治療效率。開發(fā)更為合適的基因遞送系統(tǒng)來克服這些生理屏障成為了基因治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究課題利用主動(dòng)靶向和分級(jí)調(diào)控策略設(shè)計(jì)出了具有多重響應(yīng)性的嵌段聚合物載體FA-PEG-GPLGVRG-P[Asp(DET)]。希望通過巧妙的設(shè)計(jì)將血液循環(huán),腫瘤富集,組織穿透,細(xì)胞內(nèi)化,藥物釋放五個(gè)遞送階段的遞送效率最大化。1.FA-PEG-GPLGVRG-P[Asp(DET)]的合成及表征通過點(diǎn)擊反應(yīng)、開環(huán)聚合反應(yīng)和取代反應(yīng)以葉酸(folic acid,FA)為導(dǎo)航分子,聚乙二醇(poly ethylene glycol,PEG)為親水嵌段,P[Asp(DET)]為核酸裝載嵌段合成了基因遞送系統(tǒng)。利用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)和核磁共振氫譜(~1H NMR)對(duì)聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,結(jié)果顯示嵌段聚合物FA-PEG-GPLGVRG-P[Asp(DET)]成功合成且P[Asp(DET)]嵌段的聚合度約為70。2.F-G-P/pDNA理化性質(zhì)及生物性能研究遞送載體通過靜電作用與質(zhì)粒DNA(plasmid DNA,pDNA)自組裝形成載體-基因復(fù)合物。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果顯示載體-基因復(fù)合物FA-PEG-GPLGVRG-P[Asp(DET)]/pDNA為納米球形結(jié)構(gòu)且分布均勻,粒徑約為80 nm,Zeta電位接近電中性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明F-G-P對(duì)pDNA顯著的凝縮能力以及納米粒子在血液中循環(huán)的潛力。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證明載體可以通過靜電作用有效地的與pDNA結(jié)合,中和其攜帶的負(fù)電荷,并對(duì)內(nèi)部的pDNA提供有效地保護(hù)。溶血實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示納米粒子的溶血率均小于5%且細(xì)胞存活率均大于85%,體現(xiàn)出了納米粒子良好的安全性能。此外,細(xì)胞攝取及體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞攝取和體外基因轉(zhuǎn)染效果顯著。3.F-G-P/pDNA響應(yīng)性去PEG化性能及響應(yīng)胞內(nèi)酸性環(huán)境二步質(zhì)子化性能研究通過乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)實(shí)驗(yàn),細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和共定位實(shí)驗(yàn)對(duì)載體-基因復(fù)合物經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)孵育前后的破膜能力、攝取效率及內(nèi)涵體(溶酶體)逃逸能力進(jìn)行了定性和定量的表征。LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)MMP-2孵育后的納米粒子的破膜能力明顯增強(qiáng),從而可以明顯提升納米粒子的細(xì)胞攝取效率,這與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。此外,P[Asp(DET)]嵌段具有響應(yīng)不同pH值的特性,可以響應(yīng)酸化的內(nèi)涵體完成二步質(zhì)子化,基因遞送系統(tǒng)在pH=5.5(酸化內(nèi)涵體pH)時(shí)的破膜能力要明顯大于其在pH=7.4(生理環(huán)境pH)時(shí),從而使得其具有更強(qiáng)的內(nèi)涵體(溶酶體)逃逸能力,共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。4.體外抑癌能力評(píng)測(cè)用表達(dá)可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt-1)的pDNA與遞送系統(tǒng)FA-GPLGVRG-P[Asp(DET)]結(jié)合,并設(shè)立磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)對(duì)照組和沒有主動(dòng)靶向功能的PEG-GPLGVRG-P[Asp(DET)]/pDNA實(shí)驗(yàn)組。利用U87腦膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞建立了小鼠腫瘤模型,進(jìn)行了體外抑癌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,擁有葉酸基團(tuán)的F-G-P/pDNA實(shí)驗(yàn)組展現(xiàn)出了有效的抑制效果,該實(shí)驗(yàn)組的小鼠腦部腫瘤增長(zhǎng)最為緩慢,且平均存活時(shí)間為25天,明顯大于P-G-P/pDNA實(shí)驗(yàn)組的19天及PBS對(duì)照組的12天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了葉酸基團(tuán)良好的主動(dòng)靶向性能及F-G-P遞送系統(tǒng)良好的基因治療潛力。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R943

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本文編號(hào)：2707430