【摘要】：目的:他汀類藥物作為心血管疾病的一、二級預(yù)防藥物,其在臨床的廣泛應(yīng)用大大降低心血管疾病的發(fā)病率,降低心血管疾病的死亡率。然而越來越多的研究表明:他汀類藥物的應(yīng)用與新發(fā)2型糖尿病相關(guān),但其致病機制尚不完全明確。炎癥作為獨立因素可以導(dǎo)致胰島素抵抗,是否炎癥可能成為他汀類藥物導(dǎo)致糖尿病的致敏因素,即在炎癥狀態(tài)下他汀可能導(dǎo)致胰島素抵抗,非炎癥狀態(tài)下他汀不會誘發(fā)胰島素抵抗。由于肝臟胰島素抵抗,在糖尿病形成過程中作用顯著,故本研究重點研究肝臟胰島素抵抗。炎癥可能通過誘發(fā)肝臟產(chǎn)生過多的活性氧導(dǎo)致胰島素抵抗,本研究進一步探討他汀類藥物是否可能在炎癥基礎(chǔ)上進一步增加了活性氧尤其是線粒體活性氧的生成。由于他汀類藥物可以調(diào)整肝臟細胞胞內(nèi)膽固醇代謝,而炎癥也對細胞內(nèi)膽固醇代謝平衡存在作用,胞內(nèi)膽固醇特別是線粒體膽固醇的異常堆積可以導(dǎo)致線粒體功能失調(diào),生成過量的線粒體活性氧,最終誘發(fā)胰島素抵抗,而細胞內(nèi)過量的膽固醇可通過START結(jié)構(gòu)域蛋白3(Stard3)轉(zhuǎn)運至線粒體,當(dāng)線粒體無法代謝處理過量膽固醇時,膽固醇隨即堆積于線粒體。本研究擬探討他汀是否在炎癥背景下通過上調(diào)的Stard3蛋白轉(zhuǎn)運至肝臟細胞線粒體導(dǎo)致線粒體膽固醇集聚,最終誘發(fā)肝臟胰島素抵抗。方法:第一部分,臨床數(shù)據(jù):收集內(nèi)分泌科2型糖尿病患者,糖尿病診斷時間大于等于1年,且血糖控制穩(wěn)定。排除慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝臟疾病、遺傳性肝臟疾病、急性感染期患者,且所有入選患者每日酒精攝入量均小于等于20g。采集患者基本資料(性別、年齡等)及肝臟超聲結(jié)果、體重、身高、肝功能、血脂、空腹血糖及糖化血紅蛋白。根據(jù)患者CRP值將患者分為炎癥組(CRP≥10mg/L or hsCRP≥3mg/L)及非炎癥組(CRP10mg/L or hsCRP3mg/L),再根據(jù)患者是否服用他汀類藥物將上述兩組各分為兩個亞組,即非炎癥不服用他汀組,非炎癥服用他汀組;炎癥不服用他汀組,炎癥服用他汀組。第二部分:動物實驗:通過喂養(yǎng)Apo E~(-/-)小鼠(雄性)西方飲食共8周,建立小鼠高膽固醇血癥模型,酪蛋白(casein)注射模擬炎癥狀態(tài),動物分組:對照組:隔日皮下注射0.9%生理鹽水0.5ml;2)阿托伐他汀組:隔日皮下注射0.9%生理鹽水0.5ml,阿托伐他汀10mg/kg/d口服;3)casein組:隔日皮下注射10%酪蛋白0.5ml;4)casein+阿托伐他汀組:隔日皮下注射10%酪蛋白0.5ml,阿托伐他汀10mg/kg/d口服。小鼠血清炎癥壞死因子α(TNFα)及白介素-6(IL-6)測定采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),血清自動生化儀測定小鼠血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(FC)、甘油三酯(TG)。肝臟組織切片HE染色觀察肝臟脂肪樣變程度。肝臟組織總膽固醇(TC)及游離膽固醇(FC)測定采用酶學(xué)方法檢測。肝組織甘油三酯含量采用酶偶聯(lián)比色法測定。Western blot測定小鼠肝臟組織胰島素受體底物-1(IRS-1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)、肝臟葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)、含START結(jié)構(gòu)域蛋白1(Stard1)和含START結(jié)構(gòu)域蛋白3(Stard3)的蛋白表達。RT-PCR測定stard1、stard3至stard6基因表達。肝組織新鮮冰凍切片進行DHE染色了解肝臟組織中超氧陰離子生成情況。第三部分,細胞實驗:將Hep G2細胞分為4組處理組:對照組(含0.5%BSA的DMEM培養(yǎng)基+LDL),阿托伐他汀組(含0.5%BSA的DMEM培養(yǎng)基+LDL+阿托伐他汀),TNFα組(含0.5%BSA的DMEM培養(yǎng)基+LDL+TNFα),TNFα+阿托伐他汀組(含0.5%BSA的DMEM培養(yǎng)基+LDL+TNFα+阿托伐他汀),以上共處理24小時。油紅O細胞染色了解不同處理條件下脂質(zhì)沉積情況。細胞及線粒體總膽固醇(TC)及游離膽固醇(FC)測定采用酶學(xué)方法檢測。采用膽固醇類似物(TopFluor cholesterol)攝入細胞后與細胞線粒體共染,分析不同處理條件下細胞線粒體膽固醇分布情況。采用DHE染色分析細胞內(nèi)ROS生成情況,采用膜電位依賴的mito tracker測定線粒體膜電位情況,采用Mito SOX測定線粒體ROS產(chǎn)生情況。在HepG2細胞上si RNA干擾stard3表達后再次進行線粒體膽固醇沉積、線粒體ROS產(chǎn)生、線粒體膜電位測定。結(jié)果:第一部分:在非炎癥組(CRP10mg/L or hsCRP3mg/L),他汀類藥物降低患者血TC及LDL(P0.05),對患者糖化血紅蛋白、空腹血糖及脂肪肝發(fā)病率無明顯影響(P0.05);而在炎癥組(CRP≥10mg/L or hsCRP≥3mg/L),他汀類藥物顯著升高患者糖化血紅蛋白、空腹血糖值及脂肪肝發(fā)病率(P0.05),雖然本組中血TC及LDL呈下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第二部分小鼠葡萄糖耐量及胰島素耐量實驗中,對照組與阿托伐他汀組比較兩者無統(tǒng)計學(xué)差異;而casein組與casein+阿托伐他汀組相比,casein+阿托伐他汀組葡萄糖耐量下降,胰島素敏感性降低。在炎癥狀態(tài)下,阿托伐他汀破壞胰島素信號通路(IRS-1,p-AKT/AKT),同時肝臟G6Pase表達增高,并上調(diào)Stard3蛋白表達,顯著增加肝臟甘油三酯及游離膽固醇水平(P0.05),還增加了小鼠肝臟組織ROS產(chǎn)生;而非炎癥狀態(tài)下,阿托伐他汀對上述指標(biāo)無明顯影響。第三部分在炎癥狀態(tài)下(TNFα處理),阿托伐他汀顯著增加了細胞TC及FC含量及線粒體FC含量(P0.05),增加了TopFluor cholesterol進入線粒體,增加細胞總ROS生成,降低線粒體膜電位及增加線粒體ROS生成(P0.05)。而在非炎癥狀態(tài)下,阿托伐他汀并未改變上述指標(biāo)。將stard3基因在HepG2細胞沉默后,炎癥狀態(tài)下,阿托伐他汀對于線粒體內(nèi)膽固醇聚集、線粒體ROS產(chǎn)生及線粒體膜電位,Pepck表達均無明顯影響。結(jié)論:炎癥狀態(tài)下,阿托伐他汀明顯降低小鼠肝臟胰島素信號通路,增加肝臟糖異生及肝臟脂質(zhì)沉積及肝臟組織ROS生成,阿托伐他汀通過調(diào)整細胞胞內(nèi)膽固醇含量及線粒體游離膽固醇含量,進而增加線粒體膽固醇并增加線粒體ROS生成,而非炎癥狀態(tài)下阿托伐他汀不存在該作用。
【圖文】：

圖 2.2ApoE-/-小鼠肝臟血脂測定igure 2.2 The level of hepatic FC、CE、TG in ApoE-/-mice或阿托伐他汀對ApoE-/-小鼠FC、CE、TG的影響。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（P<0.05 與 casein 組比較。atic FC、CE、TG in ApoE-/-mice after casein injection and/or atorvastatin. ResP<0.05 versus control group,#P<0.05 versus casein group.汀在炎癥/非炎癥狀態(tài)下對 ApoE-/-小鼠胰島素耐響葡萄糖耐量及胰島素耐量結(jié)果參見圖 2.3，，在非炎癥與對照組相比，阿托伐他汀未顯著改變小鼠各個時間

圖 2.3ApoE-/-小鼠葡萄糖耐量及胰島素耐量Figure 2.3 Glucose and insulin tolerance in ApoE-/-mice阿托伐他汀在炎癥/非炎癥狀態(tài)下對 ApoE-/-小鼠（A）葡萄糖耐量及（B）胰島素耐量的影響。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (n=5)表示。*P<0.05 與對照組比較，#P<0.05 與 casein 組比較。A. Glucose tolerance tests (GTT) performed after 8 weeks treatment. B. Insulin tolerance tests( ITT) performedat the end of the experiment.Data are depicted as mean±SD (n=5).*P<0.05 versus control group.#P<0.05 versuscasein group.2.4 阿托伐他汀在炎癥/非炎癥狀態(tài)下對 ApoE-/-小鼠肝臟胰島素信號通路蛋白表達的影響
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R96

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本文編號：2697968