【摘要】：鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channels,CaCCs)是許多細(xì)胞功能的基礎(chǔ),是參與多種重要生理過程的質(zhì)膜蛋白。在腸動(dòng)力調(diào)控、平滑肌收縮、上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元興奮和傷害感受等多種生理過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。選擇性調(diào)節(jié)劑的研究可為揭示多種生理病理過程中CaCCs的作用機(jī)制和分子身份提供理論基礎(chǔ)。所以篩選高親和力、選擇性強(qiáng)的CaCCs抑制劑成為了重點(diǎn)研究對(duì)象。結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29內(nèi)源表達(dá)TMEM16A和一種分子身份未知的腸上皮CaCC,本研究利用HT29/YFP-H148Q/I152L作為篩選模型,從天然小分子化合物中篩選出對(duì)腸上皮CaCC有抑制作用的藥物,發(fā)現(xiàn)了木香烯內(nèi)酯(Costunolide,Cos)、去氫木香烴內(nèi)酯(Dehydroxylinolactone,Dehy)、土木香內(nèi)酯(Alantolactone,AL)、異土木香內(nèi)酯(Isoalantolactone,iAL)可抑制腸上皮CaCC,并利用細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及電生理手段對(duì)化合物的選擇性、作用機(jī)理和分子藥理學(xué)進(jìn)行探究;在小鼠體內(nèi),對(duì)抑制劑的體內(nèi)活性進(jìn)行分析。本研究的目的是從天然產(chǎn)物中篩選親和力好,靶向性強(qiáng)的腸上皮CaCC抑制劑,并對(duì)其進(jìn)行分子藥理學(xué)研究,為揭示腸上皮CaCC的分子身份提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.利用HT29/YFP-H148Q/I152L作為測定模型,發(fā)現(xiàn)了倍半萜內(nèi)酯類化合物木香烯內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯在HT-29細(xì)胞上均以劑量依賴的方式抑制腸上皮CaCC,表觀IC_(50)值分別為21.6μM、25.3μM、28.5μM與29.8μM,且其抑制作用均具有可逆性特點(diǎn)。2.HT-29短路電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物均抑制腸上皮CaCCs,且呈劑量依賴關(guān)系。四種倍半萜內(nèi)酯類化合物IC_(50)值分別約為24.7μM、12.5μM、5.3μM與9.2μM。3.Ca~(2+)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)由ATP,CCh及ionomycin引起的HT-29細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)濃度升高均有抑制作用。4.FRT-TMEM16A細(xì)胞短路電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四種倍半萜內(nèi)酯類化合物均抑制TMEM16A氯離子通道電流,且呈劑量依賴方式。IC_(50)值分別約為18.9μM、55.4μM、34.2μM與38.5μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)TMEM16A抑制作用的濃度范圍與對(duì)HT-29細(xì)胞上的CaCCs的不同。5.T84細(xì)胞短路電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四種倍半萜內(nèi)酯類化合物在細(xì)胞頂膜側(cè)均以劑量依賴的方式抑制CFTR氯離子通道,IC_(50)值分別約約為20.3μM、9.5μM、11.1μM與14.6μM。6.小鼠結(jié)腸組織粘膜短路電流結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)小鼠結(jié)腸組織粘膜CFTR和小鼠結(jié)腸漿膜側(cè)Na~+-K~+-ATPase沒有抑制作用。7.小鼠結(jié)腸漿膜短路電流結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)K~+通道有一定抑制作用。8.小鼠結(jié)腸粘膜短路電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)小鼠結(jié)腸組織粘膜氯離子通道以劑量依賴的方式發(fā)揮抑制作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,結(jié)果顯示四種倍半萜內(nèi)酯類化合物能夠抑制小鼠腸蠕動(dòng)。新生小鼠輪狀病毒腹瀉模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯均對(duì)輪狀病毒引起的分泌性腹瀉有抑制作用,且土木香內(nèi)酯作用效果優(yōu)于異土木香內(nèi)酯。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了四種倍半萜內(nèi)酯類化合物木香烯內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯對(duì)CaCC、TMEM16A和K~+通道有抑制活性,且四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)TMEM16A其抑制作用的劑量濃度范圍與其對(duì)HT-29細(xì)胞上的CaCCs的劑量濃度范圍不同,HT-29細(xì)胞上內(nèi)源性表達(dá)TMEM16A和一種分子身份未知的腸上皮CaCC,因此可確定四種倍半萜內(nèi)酯類化合物對(duì)腸上皮CaCC有抑制作用。四種倍半萜內(nèi)酯類化合物也可抑制細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度,因此四種倍半萜內(nèi)酯類化合物可能是以抑制Ca~(2+)為靶點(diǎn)發(fā)揮其對(duì)CaCCs和K~+通道抑制作用的。四種倍半萜內(nèi)酯類化合物也可抑制CaCC介導(dǎo)的液體分泌和腸蠕動(dòng)。該發(fā)現(xiàn)為分泌性腹瀉的致病機(jī)理及治療提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)為揭示腸上皮CaCC的分子身份的確定提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

倍半萜內(nèi)酯類腸上皮鈣激活氯離子通道抑制劑的發(fā)現(xiàn)及分子藥理學(xué)機(jī)制研究a+/K+-ATPase 產(chǎn)生的 Na+梯度介導(dǎo) Cl 通過基底外側(cè)膜的攝取。因此，Cl 的靜息膜電位，從而有利于 Cl 通過頂膜側(cè)的通道分泌。研究證明 NKCC1 基在上皮細(xì)胞中分泌 Cl 的能力下降[73-75]。Cl-的分泌還基于基底外側(cè) K+通道維持細(xì)胞膜負(fù)電位非常重要。CaCCs 的 Cl 分泌也依賴于參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的協(xié)同作用。在靜息狀態(tài)下，許多類型的上皮細(xì)胞的頂膜都有上皮細(xì)ENaC)，它驅(qū)動(dòng)上皮細(xì)胞的液體的吸收。鈉離子的流入使膜去極化，從而為造了條件。因此，，CaCCs 分泌 Cl 需要平行封閉 ENaC。研究發(fā)現(xiàn)嘌呤堿作皮細(xì)胞會(huì)對(duì) CaCCs 和 ENaC 分別產(chǎn)生刺激和抑制作用[76,77]。

倍半萜內(nèi)酯類腸上皮鈣激活氯離子通道抑制劑的發(fā)現(xiàn)及分子藥理學(xué)機(jī)制研究aMKII 磷酸化產(chǎn)生抑制作用[106,107]。這種機(jī)制解除了細(xì)胞內(nèi) Ca2+瞬時(shí)變化aCC 活化的耦連作用:當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，Cl 電導(dǎo)達(dá)到峰值，但隨后下降速度 Ca2+濃度[105]。磷酸化引起的抑制機(jī)制被鈣調(diào)磷酸酶的去磷酸化所抵消[108,109
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2697658