【摘要】：外泌體(exosomes,Exos)是細(xì)胞分泌囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一個(gè)亞群,廣泛存在于體液和細(xì)胞中,具有很多親本細(xì)胞的特性,用于細(xì)胞間的通信和信號(hào)調(diào)節(jié)。最近,Exos在天然治療平臺(tái)和藥物遞送系統(tǒng)中受到越來越多的關(guān)注,并且很多研究已經(jīng)證明Exos作為藥物遞送系統(tǒng)的可行性。目的:該研究關(guān)注經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞分泌(M1-mcarophages,M1)的M1-Exos,探討其激活巨噬細(xì)胞(macrophages)的NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子,是否可以增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤活性。方法:(1)超高速離心法提取巨噬細(xì)胞來源的Exos;透射電鏡觀察(TEM)Exos形態(tài);動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和納米粒子示蹤技術(shù)(NTA)檢測Exos電位和粒徑分布;Western Blot法檢測Exos蛋白標(biāo)志物;采用激光共聚顯微鏡觀察小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1細(xì)胞)對Exos攝取;流式細(xì)胞儀檢測攝取率。(2)建立巨噬細(xì)胞/4T1共培養(yǎng)體系,驗(yàn)證M1-Exos和M2-Exos的抗腫瘤作用;采用RT-PCR法檢測NF-κB、i-κB、iNOS、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-4及IL-10的相對表達(dá)量;采用Elisa法檢測IL-4、IL-12及TNF-α的含量;采用Caspase-3試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞中Caspase-3的活性。(3)超聲法構(gòu)建M1-Exos載紫杉醇(PTX-M1-Exos)藥物遞送體系;HPLC法測定紫杉醇的包載量,并對其形態(tài)、粒徑、Zeta電位進(jìn)行表征。(4)體外選用小鼠4T1細(xì)胞為研究對象,通過MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了體外抗腫瘤研究;體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)選用4T1荷瘤小鼠模型為研究對象,通過Western Blot,TUNEL,HE等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行藥效評(píng)估。結(jié)果:(1)經(jīng)典的超高速離心法從不同巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基中,提取分離出不同類型的Exos。透射電鏡結(jié)果顯示提取物的直徑范圍30-150 nm之間,具有明顯的茶托樣雙膜結(jié)構(gòu),有的單個(gè)分布,有的聚集成群,背景較為清晰,污染物少。DLS和NTA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取物的粒徑在200 nm以下。Western Blot檢測結(jié)果顯示,Exos特異性蛋白TSG101,CD63及Alix在Exos中均有表達(dá)。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超高速離心法得到的沉淀物即為Exos。此外攝取實(shí)驗(yàn)顯示,提取出的Exos可以被小鼠腫瘤細(xì)胞4T1攝取。(2)巨噬細(xì)胞/4T1共培養(yǎng)體系中,M1-Exos可以激活巨噬細(xì)胞的NF-κB通路,使得巨噬細(xì)胞向M1型極化,釋放大量的炎性細(xì)胞因子(IL-6,IL-12和TNF-α)。同時(shí)對Caspase-3的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),M1-Exos給藥組腫瘤細(xì)胞的Caspase-3活性明顯增加,提示M1-Exos可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。(3)制備的PTX-M1-Exos載藥體系從外觀形態(tài)上看,PTX-M1-Exos載藥體系和單獨(dú)的M1-Exos一樣,呈類球狀有明顯的茶托樣雙層膜結(jié)構(gòu),平均粒徑130.9 nm和M1-Exos(78.4 nm)相比略微增加,平均電位分別為-17.5 mV和-13.7mV,超聲處理后sonicated-M1-Exos的形態(tài),粒徑和電位均沒有明顯的改變。(4)PTX-M1-Exos的體內(nèi)外藥效學(xué)研究結(jié)果表明,空白的M1-Exos(濃度40μg/mL)體外單獨(dú)對腫瘤細(xì)胞基本無毒副作用,而PTX-M1-Exos可以更好的抑制腫瘤細(xì)胞的生長。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,單獨(dú)的M1-Exos組也表現(xiàn)出抑制腫瘤生長的趨勢,M1-Exos作為載體本身并不能殺傷腫瘤細(xì)胞,但是可以通過激活體內(nèi)的免疫細(xì)胞而發(fā)揮間接的抗腫瘤作用。結(jié)論:在這項(xiàng)研究中,我們成功構(gòu)建了Exos載紫杉醇的藥物遞送系統(tǒng),將紫杉醇遞送至4T1腫瘤細(xì)胞中。其中,體內(nèi)外藥效實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)表明,Exos遞送系統(tǒng)不僅增加了PTX的水溶性和抗腫瘤作用,而且還降低了紫杉醇的毒副作用�？傊�,該課題的思路為Exos作為載體應(yīng)用于臨床提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

細(xì)胞 4T1 接種至 6 孔板（每孔大約 106個(gè)細(xì)胞養(yǎng)基，PBS 清洗兩遍，每孔加入 Exo-free 培養(yǎng) μg/mL），另設(shè)置空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng) 12 h ，1500 rpm 離心 5 min，，棄去上清。2 mL 預(yù)冷 min，重復(fù)兩次，棄去 PBS。流式細(xì)胞儀測定olt 法檢測 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志性蛋t 法檢測 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞標(biāo)志性蛋白的表1 巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白 iNOS 的表達(dá)上調(diào)；蛋白 Arg-1 表達(dá)豐度增加。

圖 2 DLS 檢測 M1-Exos 和 M2-Exos 的粒徑Fig.2 The size distribution M1-Exos and M2-Exos were measured using dynamic light scattering3.3 NTA 分析外泌體的粒徑及顆粒數(shù)NTA 分別檢測 M1-Exos 和 M2-Exos 的粒徑和顆粒數(shù)，結(jié)果如圖 3，粒子的平均密度集中在 120 nm，說明樣品粒徑較集中，以 160 nm 為 Exos 和其他囊泡的分界線，計(jì)算所提取的 Exos 的顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)均在 85%以上。Exos 沉淀經(jīng)PBS 稀釋 7500 倍后，上機(jī)檢測的濃度為 1~5×107/mL，圖 3 右側(cè)圖是 Exos 在布朗運(yùn)動(dòng)下呈現(xiàn)的白色亮點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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