【摘要】：腫瘤被作為多基因疾病,一旦控制細(xì)胞增殖的基因有缺陷就會導(dǎo)致生長調(diào)節(jié)的失控。研究表明,p53作為控制保護(hù)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移主要通路的腫瘤抑制因子,具有抑制或阻止細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化、維持基因組穩(wěn)定的功能;mdm2是p53的重要調(diào)節(jié)因子,它的表達(dá)產(chǎn)物MDM2蛋白能與p53相互結(jié)合,可以抑制p53的正常生物學(xué)功能,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展。因此,阻斷MDM2和p53的相互作用可以抑制MDM2的過度表達(dá)而釋放p53的正常功能,鑒于此,遏制MDM2蛋白對p53的作用被認(rèn)為是抗腫瘤的主要靶點之一。到目前為止,已有大量文獻(xiàn)報導(dǎo)了多種結(jié)構(gòu)類型的小分子p53-MDM2結(jié)合抑制劑,其中基于天然產(chǎn)物骨架的雜環(huán)螺環(huán)氧化吲哚類小分子抑制劑已能夠?qū)崿F(xiàn)抑制p53-MDM2的結(jié)合作用,此類化合物顯示其體外活性是最高的,但并非所有的化合物都能顯示出明顯的體內(nèi)抗腫瘤活性。為了得到更高效的p53-MDM2結(jié)合抑制劑,本課題設(shè)計以p53-MDM2為靶點,利用藥物設(shè)計的藥效團(tuán)骨架遷移原理,以氧化吲哚為基本骨架,在結(jié)構(gòu)上引入了活性基團(tuán)異VA唑,設(shè)計了新型氧化吲哚化合物,通過體外細(xì)胞水平和體內(nèi)動物實驗研究了該新型氧化吲哚化合物的抗腫瘤活性,并對其調(diào)控p53通路的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了研究。現(xiàn)將本論文的工作總結(jié)如下:(1)針對p53-MDM2靶點,以不同取代的氧化吲哚,(E)-硝基異VA唑芳烯烴與脯氨酸、肌氨酸和硫代脯氨酸這三種不同的氨基酸分別進(jìn)行反應(yīng),乙腈作為溶劑,反應(yīng)經(jīng)1,3-偶極子3+2環(huán)加成合成獲得了42個新型氧化吲哚化合物,產(chǎn)率高達(dá)90%,dr值達(dá)到20:1,結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HR-ESI-MS確證。(2)以所合成的42個新型氧化吲哚化合物為研究對象,采用MTT法開展了肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞毒性實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大部分化合物對A549細(xì)胞具有中等到強(qiáng)的增殖抑制活性,尤其是化合物5hh(IC50=15.574?m)和化合物6hh(IC50=10.842?m)對A549細(xì)胞的抑制活性都優(yōu)于陽性對照藥順鉑(IC50=18.794?m),且與陽性對照藥Nutlin-1(IC50=11.53?M)活性相當(dāng),并且都具有濃度梯度依賴性和時間梯度依賴性。在此基礎(chǔ)上,選取了MDM2蛋白分子進(jìn)行了分子對接實驗,初步探討了化合物5hh和化合物6hh與MDM2蛋白的作用模式和結(jié)合能力,進(jìn)一步驗證了所設(shè)計的小分子化合物與p53-MDM2靶點有關(guān)。(3)為了進(jìn)一步探討化合物5hh和化合物6hh的抗腫瘤機(jī)制,本研究從細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和侵襲等方面探索了化合物5hh和化合物6hh的抗腫瘤機(jī)制。首先以軟瓊脂集落形成實驗和細(xì)胞平板克隆形成實驗考察了化合物5hh和化合物6hh對肺癌細(xì)胞A549的增殖能力變化,結(jié)果表明了化合物5hh和化合物6hh都能明顯抑制A549細(xì)胞的增殖,并呈濃度依賴性(P0.01)。之后通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、AO/EB熒光染色和Annexin V-FITC/PI雙染法探索了化合物5hh和化合物6hh誘導(dǎo)A549細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的化合物5hh和化合物6hh都能引起A549細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的凋亡。接著以PI單染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測了經(jīng)化合物5hh和化合物6hh誘導(dǎo)后的細(xì)胞周期的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)化合物5hh和化合物6hh誘導(dǎo)后的細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。在此基礎(chǔ)上,采用WB實驗和RT-PCR實驗檢測了p53和MDM2的蛋白和m RNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)化合物5hh和化合物6hh誘導(dǎo)后的A549細(xì)胞,其p53的蛋白和m RNA均呈上調(diào)表達(dá),MDM2蛋白和m RNA均表達(dá)下調(diào),這不僅再次證明了設(shè)計的小分子化合物與p53-MDM2靶點有關(guān),還推測化合物5hh和化合物6hh可能是因為激活了p53信號通路,發(fā)揮其啟動腫瘤細(xì)胞凋亡和中止細(xì)胞增殖的作用,進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的效果。同時通過WB實驗檢測了凋亡相關(guān)因子Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物5hh和化合物6hh在誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的同時,引起了蛋白Bax/Bcl-2比例的上調(diào),表明了Bax蛋白和Bcl-2蛋白在化合物5hh和化合物6hh誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡過程中起著重要的調(diào)控作用。經(jīng)細(xì)胞劃痕實驗、Transwell小室遷移和侵襲實驗初步考察了化合物5hh和化合物6hh對肺癌細(xì)胞A549的遷移和侵襲能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物5hh和化合物6hh都能抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。由WB實驗分析發(fā)現(xiàn)化合物5hh和化合物6hh可下調(diào)MMP-2蛋白和VEGF的蛋白的表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移和侵襲,從而達(dá)到抗腫瘤的效果。(4)為了進(jìn)一步探究化合物5hh和化合物6hh的體內(nèi)抗腫瘤活性,本研究成功建立了Lewis肺癌小鼠移植瘤模型,體內(nèi)動物實驗結(jié)果證明了化合物5hh在高濃度時具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。綜上,本研究結(jié)果表明了針對p53-MDM2靶點設(shè)計的化合物5hh和化合物6hh均具有抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、生長和轉(zhuǎn)移的能力,且化合物5hh在高濃度時具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。本研究為新型氧化吲哚化合物的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù),為我們開發(fā)新一代抗腫瘤藥物及藥物機(jī)制研究提供了有價值的參考。
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貴州大學(xué) 2018 屆博士研究生學(xué)位論文結(jié)合位點，，進(jìn)而達(dá)到抑制二者相互結(jié)合作用的效果。研究基礎(chǔ)是目前獲得普遍認(rèn)可的p53和MDM2復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)模型。對p53 N端的11個氨基酸和MDM2 N端的109個氨基酸片段形成的復(fù)合物晶體的X衍射分析顯示，MDM2的p53結(jié)合區(qū)域含有一個深的疏水性裂隙，其主要是由芳香性和疏水性氨基酸殘基通過兩性α-螺旋和β-折疊形成的，在與MDM2接近時，p53上的結(jié)合部位可以被誘導(dǎo)構(gòu)成一個含有2.5個螺旋的兩性α-螺旋(圖1-1)，其疏水面深深插入MDM2的裂隙中(Chen etal., 1993)。

圖 1-5 部分異喹啉酮類衍生物Fig.1-5 Some isoquinolones dervatives酮衍生物（isoindolinone derivatives）ardcastle 等人首次提出了作為 p53-MDM2 結(jié)初通過活性篩選得到了三個異吲哚酮化合物過結(jié)構(gòu)改造優(yōu)化合成得到了化合物 57 個,并良好的先導(dǎo)化合物（圖 1-6），即化合物 17（0= 5.3 μM）,經(jīng) western blot 實驗結(jié)果表明，和細(xì)胞活性都有著很好的一致性，并且蛋白度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。隨后,基于核磁tural biology)的方法，該課題組進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系得它的IC50值為 0.17 μM,且該化合物在腫瘤
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R91;R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2691149