【摘要】：棲息于特殊生態(tài)環(huán)境的微生物,如:生活在高溫、高寒、高滲、高壓等極端環(huán)境的微生物、海洋微生物、植物內(nèi)生菌、動(dòng)物共生菌、稀有放線菌和粘細(xì)菌等,在其生命進(jìn)化歷程中,為適應(yīng)外部特殊環(huán)境,形成特殊的代謝途徑,因此,能產(chǎn)生特殊的次生代謝產(chǎn)物,為新藥研制提供豐富的先導(dǎo)化合物。前期實(shí)驗(yàn)從牡蠣共生球毛殼菌Cglobosu.ML-4、黃花蒿內(nèi)生菌M.roridum IFB-E012、白茅內(nèi)生菌Cglobosu.IFB-WQ、海帶內(nèi)生菌Alternariasp.TSJ-HD-1和海洋真菌P.janthinellum HKi-6中分離獲得21個(gè)天然化合物,本學(xué)位論文首先采用MTT法測(cè)定了這21個(gè)特境微生物天然產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性,測(cè)試的腫瘤細(xì)胞株為人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和人胃癌細(xì)胞株SGC-7901,陽(yáng)性對(duì)照藥為順鉑和5-氟尿嘧啶。結(jié)果發(fā)現(xiàn),mytoxin B對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用,IC50值為0.15±0.04 μg.mL-1;guxi-2、penicilone C、penicilone D、H7 和 H8 對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞有強(qiáng)增殖抑制作用,IC50值分別為 2.15±1.51、11.00±1.40、13.74±2.09、12.13±1.53 和 8.76±1.44 μg·mL-1;myrothecine A、tricycloalternarene 3a、2H-(2E)-tricycloaltemarene 12a、penicilone B 和penicilone A對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制作用,IC50值分別為25.5±1.19、45.81±4.58、49.72±1.13、15.29±1.82 和28.62±4.03 μg.mL-1;chaetoglobosin V 和tricycloalternarene F對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用,IC50值為60.5±0.93和80.31±3.84μg.mL-1;其它化合物無(wú)明顯活性。還發(fā)現(xiàn),化合物guxi-2對(duì)SGC-7901細(xì)胞有強(qiáng)增殖抑制作用,IC50值為15.21lμg·mL-1。在上述研究基礎(chǔ)上,本學(xué)位論文進(jìn)一步研究了活性化合物guxi-2、chaetoglobosin V、mytoxin B和myrothecine A的體外抗腫瘤活性機(jī)制。Guxi-2是從黃花蒿內(nèi)生菌M.roridum中分離獲得的一個(gè)新環(huán)十肽化合物,研究發(fā)現(xiàn),其能濃度依賴(lài)性地引起SGC-7901細(xì)胞G1期細(xì)胞周期阻滯;其能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡,50 μg·mL-1時(shí)凋亡率為21.91±4.26%;guxi-2能明顯降低SGC-7901細(xì)胞的遷移速率,50μg·mL-1時(shí)劃痕寬度沒(méi)有明顯變化,且細(xì)胞過(guò)膜數(shù)量明顯下降;guxi-2處理后的細(xì)胞中,Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)增加,同時(shí)Caspases-3,-8,-9蛋白表達(dá)增加。結(jié)果表明,guxi-2對(duì)SGC-7901細(xì)胞的體外抗腫瘤活性與誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞遷移速率有關(guān),其誘導(dǎo)凋亡作用可能同時(shí)涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。Chaetoglobosin V是從牡蠣共生球毛殼菌Cglobosu.ML-4發(fā)酵液中分離獲得的一個(gè)細(xì)胞松弛素化合物。研究發(fā)現(xiàn),其能濃度依賴(lài)性地引起SMMC-7721細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯;可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,50μgμg·mL-1時(shí)凋亡率達(dá)到21.89-±5.52%;chaetoglobosin V處理后的細(xì)胞中,Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)增加,同時(shí)Caspases-3,-8,-9蛋白表達(dá)增加,Akt蛋白表達(dá)和其磷酸化水平下降。上述結(jié)果表明,chaetoglobosin V對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的體外抗腫瘤活性與誘導(dǎo)G2期細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān),且該誘導(dǎo)凋亡作用可能同時(shí)涉及線粒體途徑和死亡受體途徑,并與PI3K/Akt信號(hào)通路活性相關(guān)。Mytoxin B(倍半萜部分含12,13-環(huán)氧基)和myrothecine A(mytoxin B的10,13-碳環(huán)衍生物)是從黃花蒿內(nèi)生菌M.roridum IFB-E012中分離獲得的兩個(gè)單端孢霉烯大環(huán)內(nèi)酯化合物。研究發(fā)現(xiàn),mytoxinB能顯著誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,1μg·mL-1時(shí)凋亡率就達(dá)到 22.62±0.64%,myrothecine A 誘導(dǎo)凋亡作用較弱,50μg.mL-1 時(shí)凋亡率僅為 8.85±0.11%;mytoxinB和myrothecineA處理后的細(xì)胞中,Bcl-2表達(dá)皆下降、Bax表達(dá)皆增加,同時(shí)Caspases-3,-8,-9蛋白表達(dá)皆增加;還發(fā)現(xiàn),Akt蛋白及其磷酸化水平皆下降,使用PI3K抑制劑LY294002做對(duì)照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)化合物與LY294002具有相似的活性,且與LY294002存在一定的協(xié)同作用;此外,ERK蛋白表達(dá)和其磷酸化水平皆下降,p38蛋白表達(dá)和其磷酸化水平皆增加。綜上可知,mytoxin B和myrothecine A對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的體外抗腫瘤活性與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān),且該誘導(dǎo)凋亡作用可能同時(shí)涉及線粒體途徑和死亡受體途徑,并與PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路活性相關(guān)。
【圖文】：

逡逑２和圖２），表明ｇｕｘｉ－２可誘導(dǎo)ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞的Ｇ１期細(xì)胞增多，即Ｇ１期細(xì)胞周期阻滯。逡逑表２化合物ｇｕｘｉ－２對(duì)ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞周期分布的影響邐逡逑￣化合物濃度￣￣邐細(xì)胞時(shí)相分布（％）逡逑（（ｉｇｒｎＬ＂１）邐Ｇ１邐Ｓ邐Ｇ２逡逑ＮＣ邐３７．８４邋＋邋６．５２邐５９．８８邋＋邋６．８１邐２．２８邋土邋３．８０逡逑０．１邐３９．８３±６．４邐５８．１邋±５．６６邐２．０７±３．５９逡逑１邐４２．３４邋土邋５．３３邐５６．２１邋±５．３１邐１．４５±２．５１逡逑１０邐４６．５８±７．５２邐５０．０８±８．５３邐３．３４±５．１２逡逑２０邐４９．７０±９．７０邐４６．４４±９．９８邐３．８６±５．０１逡逑５０邐５９．０６±８．６２＊邐３５．１９±７．９７邐５．７５±８．４７逡逑與陰性對(duì)照組相比，汐＜０．０５，邋“Ｐ＜０．０１逡逑ＮＣ邐０．１邋ｎｇ＇ｉｎＬ－１邐１邋ｎｇ＇ｍＬ＇１逡逑ｌ邋ｉ邋＾邋Ｉ邋＾邋Ｉ逡逑＾邋Ｉ邋Ｉ＂邋Ｉ－逡逑ＩＳ－邐灄邐１逡逑Ｉ邋Ｉ邋？邋Ｍ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｍ邋ｉ邋Ｍ邐Ｉ邋ＩＩ邋ｉ邋0１Ｍｉｌ；！Ｍｌｆｒｉｌ｜ＭＩＩ｜ｆ＃�。�°邋Ｉ邋．邋ｔ邋Ｍ邋ｊ邋

－－，度（０．１、１、１０、２０和ＳＯｕｇ．ｍｌ／１）的化合物處理ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞４８ｈ后，收集細(xì)胞，檢逡逑測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物ｇｕｘｉ－２能劑量依賴(lài)性地促進(jìn)ＳＧＣ－７９０１細(xì)胞凋亡，與ＮＣ逡逑組的４．１６±０．０８％邋（包括早期凋亡和晚期凋亡）相比，藥物處理組細(xì)胞凋亡率分別上升至逡逑４．２６±０．３６％、１１．７５±２．０３0／0邋Ｃ尸邋＜邋０．０１邋）、１２．０７±２．２７％邋（尸邋＜邋０＿０１邋）、１６．４８±３．４０％邋（尸邋＜邋０．０１邋）逡逑和邋２１．９１邋±４．２６。／。（尸＜０．０１）（表邋３邋和圖邋３）。逡逑表３化合物ｇｕｘｉ－２對(duì)ＳＭＭＣ－７７２丨細(xì)胞凋亡的影響邐逡逑化合物濃度（Ｈｇｍｌ／１）邐早期凋亡（％）邋晚期凋亡（％）邐總凋亡率（％）逡逑ＮＣ邐３．７９±０．２２邐０．３７±０．１５邐４．］６±０．０８逡逑０．１邐２．７９±０．８１邐１．４７±１．０７邐４．２６±０．３６逡逑１邐９．８９±２．１９邐１．８７±邋１．５７邐１１．７５±２．０３“逡逑１０邐１０．２１邋±１．２９邐１．８５±２．６４邐１２．０７±２＿２７＊＊逡逑２０邐１４．０３±１．３３邐２．４５±２．７７邐１６．４８±３．４０＂逡逑５０邐１８．０７邋土邋２．１８邐３．８５±３．８２邐２１．９１邋±４．２６“逡逑與陰性對(duì)照組相比，＊尸＜邋０．０５，，邐０．０１逡逑ＮＣ邐０．１邋ｐｇ邋ｍＬ＇１邐Ｉ邐ｍＬ＇１逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R915

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本文編號(hào)：2690615