發(fā)布時間：2020-05-31 15:07

【摘要】：Jaspine B是從海洋生物海綿中分離出來的天然化合物,并且對多種癌細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性。由于Jaspine B結(jié)構(gòu)的特殊性,許多Jaspine B衍生物被合成進(jìn)行研究,并且發(fā)現(xiàn)針對部分癌細(xì)胞具有明顯的活性,能夠限制癌細(xì)胞的增殖生長,但是其抗癌機(jī)制探索不夠深入,而且針對胃癌細(xì)胞內(nèi)部信號通路研究比較少見。在本課題中,Jaspine B衍生物ZE-2化合物對胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用,主要探究本化合物怎樣抑制胃癌細(xì)胞增殖和其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡的信號傳導(dǎo)過程。其結(jié)果如下:1.MTT實驗檢測到ZE-2抑制了胃癌細(xì)胞(MGC803、HGC27和SGC7901)的生長,其中抑制MGC803增殖現(xiàn)象最明顯,并且對正常的人胃上皮細(xì)胞GES-1沒有明顯的毒性。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,ZE-2誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,并且蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測到促進(jìn)凋亡執(zhí)行的蛋白表達(dá)被上調(diào)。2.用JC-1熒光探針檢測到ZE-2導(dǎo)致胃癌細(xì)胞(MGC803和HGC27)線粒體膜電位降低,蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測到促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)降低,表明ZE-2通過線粒體內(nèi)部途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3.用倒置顯微鏡觀察ZE-2(2μM)處理MGC803 24 h細(xì)胞形態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡化,具有豐富的小囊泡結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測到自噬相關(guān)蛋白LC3-II、Beclin-1、Atg3與Atg12的表達(dá)增加,表明ZE-2誘導(dǎo)了自噬。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測到MAPK途徑中的JNK和ERK蛋白被磷酸化,以及JNK抑制劑SP600125和ERK抑制劑SCH772984可以逆轉(zhuǎn)ZE-2誘導(dǎo)的LC3-II蛋白質(zhì)表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示ZE-2可以使Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL蛋白復(fù)合物發(fā)生解離以及SP600125和SCH772984可抑制Beclin-1-Bcl-2/Bcl-xL復(fù)合體解離,以上結(jié)果表明ZE-2是通過JNK/ERK-Bcl-2/Beclin-1/Bcl-xL級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)自噬。4.蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測到P62隨著ZE-2作用時間的延長不斷增加,由于P62結(jié)構(gòu)的特殊性,P62可與各種結(jié)合配體相互作用,并作為各種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的信號傳導(dǎo)中樞。蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測到當(dāng)ZE-2(4μM)與MGC803共同孵育6 h時,P62與Keap1蛋白結(jié)合,Nrf2信號下游蛋白HO-1和NQO1都明顯增加,核質(zhì)分離實驗顯示隨著時間的增加Nrf2在細(xì)胞核中的表達(dá)量逐漸增加,并且在6 h達(dá)到最高值,然而其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量逐漸降低,Nrf2染色免疫熒光實驗顯示了Nrf2集中分布在細(xì)胞核中,以上結(jié)果表明ZE-2在誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞死亡過程中激活了Nrf2保護(hù)機(jī)制。5.探索P62-Nrf2途徑與凋亡之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示JNK抑制劑SP600125和ERK抑制劑SCH772984可以降低由ZE-2誘導(dǎo)的P62與Keap1蛋白的結(jié)合,并且可以下調(diào)P62以及Nrf2下游蛋白HO-1和NQO1的表達(dá),Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)顯示SP600125和SCH772984增加了ZE-2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示自噬早期抑制劑LY294002降低了P62和HO-1的表達(dá),MTT顯示LY294002降低了ZE-2誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率,Beclin-1~(-/-)細(xì)胞株更加敏感,以及P62 siRNA可以進(jìn)一步增強(qiáng)ZE-2所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡;蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示自噬晚期抑制劑BafA1使P62與Keap1蛋白結(jié)合程度增加,MTT實驗結(jié)果顯示BafA1可以限制ZE-2所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。以上數(shù)據(jù)表明JNK/ERK誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生,可以使P62表達(dá)量增加后激活Nrf2信號通路,在一定程度上抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述,ZE-2通過線粒體內(nèi)部途徑誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞凋亡性死亡,同時通過JNK/ERK途徑誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象,使P62蛋白表達(dá)量增加,進(jìn)一步激活Nrf2信號通路抵御ZE-2所誘導(dǎo)的凋亡,但隨著時間的延長或者ZE-2濃度的增加,細(xì)胞凋亡程度不斷增強(qiáng),胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡從而限制細(xì)胞的生存。
【圖文】：

用現(xiàn)在已被人們探索，并且發(fā)現(xiàn)作用，，但是其抗癌機(jī)制研究不夠較少見。本課題以胃癌細(xì)胞系為合成了目標(biāo)化合物 ZE-2（圖 1.2）染法、免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)及從細(xì)胞及分子方面，探索 ZE-2 對闡明其抗胃癌細(xì)胞作用機(jī)理，期的潛在藥物。圖 1.1 Jaspine B 的結(jié)構(gòu)

JaspineB的結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2690044