【摘要】：慶大霉素是多組分混合物,在采用管碟法測定其含量時(shí),常常存在標(biāo)準(zhǔn)品與樣品之間不同質(zhì)問題。因此,需要建立新的慶大霉素含量測定的方法并與管碟法進(jìn)行比較。經(jīng)過查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)近年來慶大霉素的含量測定方法有微生物檢定法、旋光法、光譜法、色譜法等。與管碟法比較,旋光法與光譜法也可以測定慶大霉素全部組分的含量,但旋光法的靈敏度太低。通過對光譜法的比較分析,發(fā)現(xiàn)紫外可見分光光度法具有靈敏度高、檢測快速等優(yōu)點(diǎn),這可以作為建立慶大霉素含量測定方法的研究方向。根據(jù)慶大霉素的化學(xué)性質(zhì),本文尋找到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的水楊醛試劑。經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水楊醛與慶大霉素在常溫下發(fā)生衍生化學(xué)反應(yīng),且衍生產(chǎn)物在400nm波長處有最大紫外可見吸收。采用單因素多水平設(shè)計(jì)方法,優(yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果顯示水楊醛與慶大霉素在pH5.5的磷酸鹽緩沖液中,經(jīng)過50℃水浴20分鐘,衍生產(chǎn)物的吸收度值最大,實(shí)驗(yàn)條件最佳。采用最佳實(shí)驗(yàn)條件,依據(jù)《中國藥典》規(guī)定的指導(dǎo)原則,進(jìn)行紫外可見分光光度法測定慶大霉素含量的方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果顯示本方法的特異性好;在280～519 U/ml的濃度范圍內(nèi),衍生產(chǎn)物的吸光度值(A)與慶大霉素濃度值(C)之間具有良好的線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.0007C+0.0186,R 值達(dá)到 0.999;平均回收率為 100.09±0.8%,RSD 為 0.7%(n=7);衍生產(chǎn)物在0～10分鐘內(nèi)穩(wěn)定。同時(shí),采用管碟法測定慶大霉素的含量。按照菌懸液制備、培養(yǎng)基制備、滅菌、供試液制備、雙碟制備、滴加供試液、培養(yǎng)、抑菌圈測量的流程進(jìn)行試驗(yàn),并將測量的抑菌圈直徑按照生物檢定統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行可靠性檢測、可信限率及效價(jià)計(jì)算。獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)4次。結(jié)果顯示,1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性檢測參數(shù)試品間(F1)不符合判定要求;1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信限率為7.96%,不符合硫酸慶大霉素注射液標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(不超過7%)的要求;含量結(jié)果平均值為 101.10%,RSD 為 1.7%(n=4)。最后,將紫外可見分光光度法與管碟法進(jìn)行比較研究。首先分別用紫外可見分光光度法與管碟法測定硫酸慶大霉素注射液中慶大霉素的含量,并將各自檢測結(jié)果進(jìn)行比較:然后將紫外可見分光光度法與管碟法的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果、硫酸慶大霉素注射液中慶大霉素含量測定結(jié)果的顯著差異性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示紫外可見分光光度法測定慶大霉素含量平均值為100.43%,RSD為1.2%(n=104);管碟法測定慶大霉素含量的平均值為101.10%,RSD為1.7%(n=4);紫外可見分光光度法的線性與范圍為280～519 U/ml、線性關(guān)系R值為0.999、回收率為100.09%±0.8%、RSD為0.7%;管碟法的線性與范圍為2～12 U/ml、回收率為100.80%±1.5%/98.7%±1.5%、RSD為1.7%;根據(jù)t分布檢驗(yàn)法,在P0.05的置信區(qū)間內(nèi),t=0.88,小于 1.98[t(0.05,106)]。本文建立紫外可見分光光度法測定慶大霉素含量的方法,具有檢測快速,操作方便的特點(diǎn)。同時(shí)方法的特異性好、靈敏度與準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好,但是衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性欠佳。與管碟法比較,兩個(gè)方法的結(jié)果無顯著性差異,但紫外可見分光光度法的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性更優(yōu)。因此,紫外可見分光光度法滿足慶大霉素含量測定的常量分析要求,能為控制其質(zhì)量提供新的參考依據(jù),進(jìn)而保障慶大霉素使用的安全性與有效性。
【圖文】：

在結(jié)構(gòu)上均是由２－脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成，其中２－脫氧鏈霉胺屬逡逑于氨基糖，絳紅糖胺、加拉糖胺屬于氨基環(huán)醇。２－脫氧鏈霉胺分別在４、６位上通過氧橋與逡逑絳紅糖胺、加拉糖胺連接。其結(jié)構(gòu)式見圖１。逡逑Ｒ邋ＨＯ邋邐邐0逡逑ｈ２ｎ，逡逑圖１慶大霉素組分分子結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ逡逑從結(jié)構(gòu)分析，慶大霉素組分分子結(jié)構(gòu)中無共軛體系，不會產(chǎn)生紫外可見或熒光吸收，逡逑無法直接運(yùn)用紫外可見分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)檢測，但所有組分均含有伯氨基，其中ｃ２、逡逑ｃ２ａ、ｃ２ｂ是同分異構(gòu)體，均可發(fā)生伯氨基的化學(xué)反應(yīng)。逡逑因此，可根據(jù)席夫堿反應(yīng)原理，利用慶大霉素各組分均具有氨基的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，與水楊逡逑醛進(jìn)行衍生反應(yīng)，通過優(yōu)化條件，探索與建立紫外可見分光光度法測定慶大霉素含量的新逡逑方法。逡逑１材料逡逑１．１紫外可見分光光度法材料逡逑１．１．１試劑逡逑磷酸氫二鉀，ＡＲ，邋５００ｇ，汕頭市西隴化工廠有限公司；磷酸二氫鉀，ＡＲ，５００ｇ，上海逡逑凌峰化學(xué)試劑有限公司；乙酸（冰乙酸）

３．１．１最大吸收波長的確定逡逑以波長（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）為橫坐標(biāo)，溶液的吸光度（Ａｂｓ）為縱坐標(biāo)，慶大霉素與水楊醛衍生逡逑化反應(yīng)的產(chǎn)物在４００±２ｎｍ波長處有最大吸收峰（見圖２）。因此，慶大霉素與水楊醛衍生逡逑化反應(yīng)的產(chǎn)物的最大吸收波長為４００ｎｍ，可作為紫外可見分光光度法的檢測波長。逡逑Ｏ．邋５邋－逡逑Ｏ．邋４邋－邐．逡逑Ａ邐：逡逑ｔ）邋0？邋３邋－邐＾邐邐－逡逑日：：：－逡逑０．０邋１邋邐－邋－邐邋１逡逑３６０邐３７０邐３８０邐３９０邐４００邐４１０邐４２０邐４３０邐４４０邐４５０邐４６０逡逑ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ（ｎｍ〉逡逑圖２紫外可見分光光度法測定衍生化產(chǎn)物的最大吸收波長逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍａｘｉｍｕｍ邋ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ邋ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋ｏｆ逡逑ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ邋ｂｙ邋ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ逡逑３．１．２反應(yīng)溫度的選擇逡逑在４００ｎｍ波長處分別檢測３０°Ｃ、４０°Ｃ、５０°Ｃ、６０°Ｃ、６５°Ｃ水浴條件下的慶大霉素衍逡逑生化反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度（見表１），，結(jié)果溫度在３０°Ｃ？５ＣＴＣ的范圍內(nèi)，溫度升高，產(chǎn)物的逡逑吸光度值增大，當(dāng)溫度達(dá)到５０°Ｃ及以上時(shí)，慶大霉素與水楊醛反應(yīng)完全，產(chǎn)物的吸光度達(dá)逡逑到最大值。因此，最佳反應(yīng)溫度可選擇為５０°Ｃ。逡逑３．１．３酸度的選擇逡逑在４００ｎｍ波長處分別檢測ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０酸度條件下的慶大霉素衍生逡逑化反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度（見表１邋），結(jié)果酸度在ｐＨ４．０時(shí)，慶大霉素與水楊醛幾乎不發(fā)生反應(yīng)；逡逑酸度在ｐＨ５．０時(shí)
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.32;R927.2

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本文編號：2687718