【摘要】：甾體化合物廣泛存在于自然界中,在甾體母體中引入雜原子,雜環(huán)或取代一個(gè)或多個(gè)原子通常會(huì)導(dǎo)致其生物學(xué)特性的改變。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),B降膽甾苯并咪唑化合物具有良好的體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性,為進(jìn)一步研究其抗腫瘤活性機(jī)制,本文設(shè)計(jì)了以下三個(gè)部分內(nèi)容:一、選取體外抑制增殖活性較好的四個(gè)B降膽甾苯并咪唑化合物,采用MTT法與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定四個(gè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外增殖活性與細(xì)胞遷移能力的影響,并利用Annexin V-FITC/PI法,細(xì)胞周期法和線粒體膜電位等流式細(xì)胞術(shù)研究化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制;二、采用蛋白免疫印跡western blot法研究了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá);三、UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)細(xì)胞代謝組學(xué)分析方法探究其靶點(diǎn),探討B(tài)降膽甾苯并咪唑化合物的抗腫瘤機(jī)制,為該類化合物的藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:1、檢測(cè)了B降膽甾苯并咪唑化合物對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SKOV 3)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞(T47D)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)等4種人性腺腫瘤細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B降膽甾苯并咪唑化合物能夠有效的抑制4種人性腺腫瘤細(xì)胞的增殖,其中對(duì)SKOV 3細(xì)胞有良好抑制遷移作用;此外B降膽甾苯并咪唑化合物還可以誘導(dǎo)SKOV 3細(xì)胞凋亡,阻滯其生長(zhǎng)S期,引發(fā)線粒體膜電位崩潰。2、運(yùn)用免疫印跡蛋白法(western blot)檢測(cè)相關(guān)凋亡因子PARP、caspase-9、caspase-3、Bax及Bcl-2的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B降膽甾苯并咪唑化合物激活線粒體途徑信號(hào)通路誘導(dǎo)SKOV 3細(xì)胞凋亡。3、采用正、負(fù)離子模式相結(jié)合的UHPLC-QE-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析方法,對(duì)連接不同取代基團(tuán)的B降膽甾苯并咪唑化合物1、2進(jìn)行藥物作用后的SKOV 3細(xì)胞代謝產(chǎn)物分別與陰性對(duì)照組的細(xì)胞內(nèi)代謝物差異及其代謝通路變化進(jìn)行對(duì)比探究。結(jié)果表明:(1)化合物1干擾主要涉及9條代謝通路:精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、組氨酸代謝(Histidine metabolism)、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(Cysteine and methionine metabolism)、氨�；�-tRNA生物合成(Aminoacyl-tRNA biosynthesis)、嘌呤代謝(Purine metabolism)、谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝(D-Arginine and D-ornithine metabolism)以及氮代謝(Nitrogen metabolism)。從代謝組學(xué)角度分析了化合物1通過干擾SKOV 3細(xì)胞氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成,減緩能量代謝,從而抑制其腫瘤細(xì)胞的增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。(2)化合物2作用SKOV 3細(xì)胞后,發(fā)生改變的代謝通路主要涉及甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝、嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine,serine and threonine metabolism)、醚脂代謝(Ether lipid metabolism)5條代謝通路。其中影響最大、富集程度最深的代謝通路是甘油磷脂代謝。甘油酸酯在細(xì)胞膜功能與結(jié)構(gòu)中發(fā)揮主要的作用,由此可知,化合物2主要是通過干擾SKOV 3細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或功能抑制其增殖。此外,還涉及精氨酸和脯氨酸代謝,所以化合物2同樣也可以抑制SKOV 3細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

.3.2 B 降膽甾苯并咪唑化合物對(duì) SKOV 3 細(xì)胞遷移的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)主要用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，將 SKOV 3 細(xì)胞接種到 6板中，待細(xì)胞融合率達(dá)到 70%-80% 時(shí)，然后用 200 μL 吸頭制造劃痕，使用有添加胎牛血清（FBS）的非完全培養(yǎng)基進(jìn)行 B 降膽甾苯并咪唑化合物濃度梯稀釋配置，使其細(xì)胞失去增殖能力，化合物處理后通過分別測(cè)定 0 h、24 h 劃寬度的變化來研究細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果如圖所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BControl 15 μmol·L-1μmol·L-10 h24 h130 μmol·L-1μmol·L-1

降膽甾苯并咪唑化合物處理組的劃痕愈合速度顯著慢于 DMSO 對(duì)照組的劃痕愈合速度，說明 B 降膽甾苯并咪唑化合物能抑制 SKOV 3 細(xì)胞的遷移能力。2.3.3 B 降膽甾苯并咪唑化合物對(duì) SKOV 3 細(xì)胞凋亡的影響本實(shí)驗(yàn)采用 Annexin V/PI 法，按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)化合物 1-4 以 0 ~ 40 μmol·L-1分別處理 24 h、48 h 是否誘導(dǎo) SKOV 3 細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，化合物 1-4 均能明顯誘導(dǎo) SKOV 3 細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。由圖 2-3 可得，在化合物處理前 SKOV 3 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，隨著化合物的添加，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變。當(dāng)化合物濃度達(dá)到 30μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞收縮變圓，出現(xiàn)凋亡小體，，且隨著化合物濃度的增大，細(xì)胞收縮程度越明顯。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：當(dāng)化合物作用 SKOV 3 細(xì)胞 24 h 后，化合物 1-4 均可明顯誘導(dǎo) SKOV 3 細(xì)胞晚期凋亡。10 μmol·L-1、20 μmol·L-1的化合物作用 SKOV 3細(xì)胞 24 h后，沒有產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)凋亡作用，但當(dāng)濃度增大為30 μmol·L-1與 40μmol·L-1，產(chǎn)生顯著凋亡現(xiàn)象。當(dāng)濃度為 30 μmol·L-1時(shí)，化合物 1-4 晚期凋亡細(xì)胞比例分別為 15.24%、9.33%、20.03% 和 10.40%；當(dāng)濃度為 40 μmol·L-1時(shí)，
【學(xué)位授予單位】：南寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 岳磊;張W

本文編號(hào)：2680931