【摘要】：納米技術(shù)可以提高癌癥化學(xué)治療的療效。納米藥物應(yīng)用于癌癥治療具有多種優(yōu)勢(shì),例如可提高疏水藥物的溶解性、增加載藥量、延長循環(huán)系統(tǒng)時(shí)間、改進(jìn)腫瘤靶向性、促進(jìn)細(xì)胞攝取、促進(jìn)藥物的溶酶體逃逸以及藥物的應(yīng)答釋放等。盡管如此,只有較少部分(1%)藥物通過生物分布過程最終在腫瘤組織中積累,其余大多數(shù)的納米藥物進(jìn)入了其他健康的器官,尤其是肝臟。肝臟是新陳代謝的主要部位,也是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分。由于肝巨噬細(xì)胞對(duì)納米藥物的作用,肝臟中通常有大量的藥物積累,這可能會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。當(dāng)被納米載體包載的藥物具有嚴(yán)重肝毒性時(shí)使得這種作用更加明顯。很多化療藥物具有嚴(yán)重的肝毒性。甲氨蝶呤(MTX),作為一種有效的細(xì)胞毒性藥物廣泛應(yīng)用于急性白血病,惡性淋巴瘤等癌癥的治療。甲氨蝶呤與葉酸結(jié)構(gòu)相似,可以和二氫葉酸還原酶結(jié)合,阻斷葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸,因而抑制細(xì)胞內(nèi)一碳轉(zhuǎn)移,使得DNA及RNA的合成受阻。甲氨蝶呤已被證實(shí)具有較強(qiáng)的肝毒性,能誘發(fā)肝纖維化甚至肝硬化,這使得其臨床應(yīng)用受到限制。盡管甲氨蝶呤造成肝毒性的機(jī)理尚不十分明確,但眾多研究表明其造成的氧化應(yīng)激現(xiàn)象是產(chǎn)生肝毒性的重要原因。肝保護(hù)分子被認(rèn)為是緩解納米藥物產(chǎn)生肝毒性的有效手段。齊墩果酸(OA)是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物,研究表明其對(duì)由各種化學(xué)物質(zhì)引起的急性肝損傷以及慢性肝纖維化具有保護(hù)作用。目前,OA已作為治療肝臟疾病的非處方藥在中國上市。OA產(chǎn)生肝保護(hù)的機(jī)理較為復(fù)雜,其中激活核轉(zhuǎn)錄因子(Nrf2)緩解氧化應(yīng)激的機(jī)理被普遍認(rèn)為是產(chǎn)生肝保護(hù)作用的主要原因。此外,齊墩果酸還具有抗腫瘤,抗骨質(zhì)疏松,抗炎,降脂等眾多藥理作用。然而,其較差的水溶性(Log P=7.5)限制了其臨床應(yīng)用和治療效果。傳統(tǒng)的物理載藥方式載藥量通常較低(5%),并不能很好的改善這一問題。兩親性前藥膠束納米載體可有效提高載藥量并控制不同藥物遞送比例。響應(yīng)型納米粒子的設(shè)計(jì)可進(jìn)一步加速藥物在細(xì)胞中的釋放,從而更好的提高藥效。細(xì)胞中內(nèi)涵體/溶酶體的酸性微環(huán)境為藥物的按需釋放提供了可能。本課題設(shè)計(jì)了一種pH敏感型OA前藥膠束載體包載MTX作為概念模型來緩解化療產(chǎn)生的肝毒性。腙鍵作為pH敏感基團(tuán)對(duì)OA和聚乙二醇(PEG)進(jìn)行連接,從而得到兩親性聚合物。腙鍵的引入使得OA前藥膠束具有pH響應(yīng)特性,可使膠束在靶向部位快速裂解釋放藥物,從而實(shí)現(xiàn)抗癌、保肝的雙重作用。首先,利用果糖酸(LA)修飾OA得到LA-OA,然后和單端為酰肼的mPEG進(jìn)行反應(yīng)得到具有腙鍵的兩親性聚合物mPEG-OA。核磁共振譜圖,紅外譜圖及紫外譜圖結(jié)果均證明目標(biāo)聚合物的成功合成。OA的載藥量為17.6%(w/w)。OA,LA-OA及mPEG-OA的紫外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜無明顯差異。利用OA的自身熒光測(cè)定得到mPEG-OA的臨界膠束濃度(CMC)為27.3±0.4μg/mL(10.5±0.2μM),較低的CMC數(shù)值說明制備的聚合物膠束具有良好的稀釋穩(wěn)定性。MTX通過透析的方法物理包載于mPEG-OA中,透析介質(zhì)為pH=8.0的氨水以維持腙鍵的穩(wěn)定性。經(jīng)高效液相色譜測(cè)定MTX的載藥量為5.1±0.3%(w/w)。MTX較多包載于疏水性空腔內(nèi)可能是由于MTX和OA之間的氫鍵作用,由于其化學(xué)結(jié)構(gòu),兩者均可作為氫的供體和受體。經(jīng)DLS測(cè)定,空白膠束(OA-NCs)和載藥膠束(OA-NCs/MTX)的水力學(xué)半徑分別為69±6 nm和101±10 nm。TEM結(jié)果證實(shí)兩種膠束均為粒徑均一的圓球狀,粒徑分別為35±5 nm和67±8 nm。包載MTX后膠束粒徑增加。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)分別在中性(pH=7.4)及酸性(pH=5.0)條件下測(cè)定。LA-OA及MTX釋放結(jié)果均表現(xiàn)出良好的pH依賴性,即酸性條件下藥物釋放量明顯高于中性條件,從而證實(shí)膠束具有pH響應(yīng)特性。此外,利用MTT法分別對(duì)載藥膠束和空白膠束進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。OA,LA-OA及OA-NCs的細(xì)胞毒性結(jié)果表明,三種樣品的OA濃度均為60μM且孵育48 h時(shí)4T1細(xì)胞存活率依舊高于70%,說明三種樣品的細(xì)胞毒性相對(duì)較小。MTX和OA-NCs/MTX樣品同樣孵育4T1細(xì)胞48 h進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算可得兩樣品的IC_(50)分別為29.4±3.5μM和22.0±2.6μM。OA-NCs/MTX的細(xì)胞毒性高于游離藥物,可能由于其中包含的OA產(chǎn)生的毒性。mPEG-OA的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)在4T1細(xì)胞中開展,利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行分析。由于OA的熒光發(fā)射峰位于400 nm以內(nèi),利用摩爾比為1:1的mPEG-FITC和mPEG-OA通過透析的方式制備了FITC標(biāo)記的混合膠束。mPEG-FITC中mPEG的分子量為1,000 Da以確保其自組裝能力。水力學(xué)粒徑的測(cè)定間接證實(shí)了混合膠束的成功制備。共聚焦圖片顯示隨著時(shí)間的延長,細(xì)胞中FITC的熒光逐漸增強(qiáng),從而說明混合膠束的不斷攝取。已知MTX是一種特定的細(xì)胞周期抑制劑,是由于其抑制二氫葉酸還原酶從而阻斷葉酸轉(zhuǎn)變成四氫葉酸,影響嘌呤新合成和脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账?使DNA及RNA的合成受阻。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中,MTX實(shí)驗(yàn)組S期較正常細(xì)胞明顯升高,可知MTX將細(xì)胞周期阻滯在S期,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。細(xì)胞經(jīng)OA前藥膠束處理后G_2/M期升高,可知OA對(duì)于4T1細(xì)胞也具有一定的細(xì)胞周期阻滯作用。載藥膠束OA-NCs/MTX同時(shí)含有OA和MTX兩種藥物,細(xì)胞周期結(jié)果顯示S期較正常細(xì)胞明顯升高,而G_2/M期較游離MTX實(shí)驗(yàn)組升高但仍較低于正常細(xì)胞。為了探究共軛膠束的生物分布,利用透析的方法制備了Cy5和MTX共包載的膠束。利用熒光測(cè)定Cy5的包載量為1.2%(w/w)。將制得的熒光膠束通過尾靜脈注射于具有4T1腫瘤模型的BALB/c小鼠體內(nèi)作為實(shí)驗(yàn)組,注射游離Cy5的小鼠作為對(duì)照組。由活體成像結(jié)果可知,實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度在注射后6-8小時(shí)達(dá)到峰值,符合實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,即EPR效應(yīng))。相反,對(duì)照組的熒光強(qiáng)度從注射后3小時(shí)到24小時(shí)均明顯低于實(shí)驗(yàn)組(p0.05),說明膠束遞送可有效延長藥物在體內(nèi)的血液循環(huán)時(shí)間并且能將藥物更多的遞送到腫瘤部位。體外器官成像結(jié)果可知,Cy5在主要的器官中也有一定積累,例如:肝、腎、肺等,這可能與Cy5的代謝路徑有關(guān)。隨后進(jìn)行了體內(nèi)抗癌及肝保護(hù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。在BALB/c小鼠腋下部位接種4T1細(xì)胞以建立腫瘤模型。實(shí)驗(yàn)分為五組:1.對(duì)照組(正常小鼠);2.PBS;3.游離藥物MTX;4.OA前藥膠束(OA-NCs);5.載藥膠束(OA-NCs/MTX),每組6只小鼠。所有樣本中,MTX和OA的給藥量相同。治療周期內(nèi)每隔48 h量取腫瘤體積,由此可得腫瘤抑制能力如下:OA-NCs/MTXfree MTXOA-NCsPBS。MTX和OA均具有抗腫瘤作用,且膠束更易聚集在腫瘤部位,因此載藥膠束表現(xiàn)出最好的腫瘤抑制效果,和預(yù)想結(jié)果一致。由于MTX比OA作為抗腫瘤藥物的作用更強(qiáng),所以MTX比OA前藥膠束具有更好的抗腫瘤效果。并且治療周期內(nèi)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠體重并未出現(xiàn)顯著變。療效研究的最后,所有小鼠通過眼球取血后取出腫瘤組織及主要器官。從四個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠收集到的腫瘤質(zhì)量經(jīng)測(cè)定與腫瘤抑制曲線一致。同樣,五組小鼠的肝臟也全部收集,肝臟相對(duì)整個(gè)小鼠體重的質(zhì)量百分比,被用來間接說明肝毒性。游離MTX組的相對(duì)肝重較正常組顯著增加,而OA-NCs/MTX組在相同MTX劑量下的相對(duì)肝重雖高于正常組但相比MTX組明顯降低(p0.01)。這可能是由于OA發(fā)揮肝保護(hù)作用從而降低了MTX產(chǎn)生的肝毒性。腫瘤組織制作成石蠟切片,通過HE染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)行組織學(xué)分析,證實(shí)了OA-NCs/MTX良好的抗癌效果。同樣,為探究不同樣品導(dǎo)致的癌癥細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了TUNEL染色實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明OA-NCs/MTX處理的腫瘤組織中凋亡細(xì)胞最多,與HE實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致,從而說明其具有良好的抗腫瘤效果。為了探究OA對(duì)于MTX造成的肝損傷的緩解作用,對(duì)肝毒性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。取出的各組小鼠血液靜置離心后得到血清,對(duì)血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性進(jìn)行測(cè)定。共遞送OA和MTX的pH敏感型膠束(OA-NCs/MTX)組的ALT和AST活性與MTX組相比明顯減少(p0.01)而與OA前藥膠束組相比無顯著性差別(p0.05),說明OA可有效降低MTX造成的肝損傷。乳酸脫氫酶(LDH)在組織損傷和細(xì)胞損傷中可被釋放,利用試劑盒對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)定。由結(jié)果可知,OA的存在可以顯著降低由MTX引起的血清中LDH的升高。取出的各組小鼠肝臟分為兩部分,一部分利用預(yù)冷的生理鹽水制成10%(w/v)肝組織勻漿,另一部分固定在4%的多聚甲醛中待組織學(xué)檢測(cè)。利用試劑盒對(duì)肝臟勻漿中ALT、AST和LDH的活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果與血清中相應(yīng)指標(biāo)趨勢(shì)一致,說明將MTX包載于共軛膠束OA-NCs中可減少肝組織中這三種指標(biāo)活性。眾多文獻(xiàn)表明MTX引起的肝損傷涉及氧化應(yīng)激(OS)現(xiàn)象。氧化應(yīng)激一般包含活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生和對(duì)正常氧化還原反應(yīng)的干擾,這很容易導(dǎo)致組織損傷。丙二醛(MDA)作為一個(gè)典型的OS指標(biāo),通過試劑盒對(duì)其在肝勻漿中的含量進(jìn)行測(cè)定。由于MTX的作用,MDA含量與正常組相比顯著增加,而經(jīng)OA-NCs/MTX治療的小鼠MDA含量較MTX組明顯下降趨近于正常組(p0.01)。此結(jié)果說明OA可有效降低MDA的產(chǎn)生。同樣作為氧化應(yīng)激指標(biāo)的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)可減少不同類型的ROS,保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。MTX治療后使得GSH-Px和SOD的酶活降低,但是OA-NCs/MTX扭轉(zhuǎn)了這一趨勢(shì),說明OA可有效緩解OS從而起到肝保護(hù)作用。肝組織的HE染色顯示,游離藥物MTX治療后的肝臟組織表現(xiàn)出在中央靜脈周圍的壞死病灶、炎癥細(xì)胞浸潤、空泡變性等,說明MTX產(chǎn)生的嚴(yán)重肝毒性。此外,PBS組也呈現(xiàn)一定程度的肝損傷,可能是由于癌癥本身產(chǎn)生的器官損傷。相反,經(jīng)過OA-NCs/MTX和OA-NCs治療的小鼠比MTX和PBS組顯示的肝臟病變明顯減少,而OA-NCs組較OA-NCs/MTX組表現(xiàn)出較少的炎癥細(xì)胞浸潤并且最接近正常肝臟,進(jìn)一步證明OA前藥膠束可有效治療肝損傷。此外,還通過TUNEL染色實(shí)驗(yàn)對(duì)肝臟部分進(jìn)行了分析。所有的樣本中均未出現(xiàn)明顯的綠色熒光,意味著在肝臟部分沒有明顯的細(xì)胞凋亡。但MTX組的細(xì)胞核與正常組相比呈異常分布,而經(jīng)過OA治療后的小鼠肝臟結(jié)果趨近于正常組織,與HE結(jié)果一致。綜上所述,本課題設(shè)計(jì)的新型OA前藥膠束具有良好的pH響應(yīng)特性,可有效緩解MTX導(dǎo)致的肝毒性。本課題采用的肝保護(hù)方法適用于多種抗腫瘤藥物和保肝材料,可為減少化療產(chǎn)生的肝毒性提供了一種新的思路。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R943

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