【摘要】：目的:免疫系統(tǒng)是機(jī)體最重要的一道屏障,肩負(fù)著機(jī)體防御、監(jiān)視、穩(wěn)定等職能,免疫功能正常是機(jī)體健康的重要基石。苯是一種有毒的環(huán)境污染物,可以影響機(jī)體的免疫系統(tǒng),并且引起造血系統(tǒng)惡性腫瘤。前人的研究表明多種途徑可能參與這一過程,包括氧化應(yīng)激,DNA損傷,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和程序性細(xì)胞死亡等,但是苯誘導(dǎo)的免疫毒性具體機(jī)制尚未完全闡明。本文擬通過構(gòu)建苯染毒小鼠模型,從免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子等多個(gè)水平研究苯染毒對小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞及脾臟的免疫毒性,為進(jìn)一步探究苯的免疫毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。方法:1.將40只6-8周齡的雄性無特定病原體級BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組:對照組(玉米油)、低劑量組(50mg/kg)、中劑量組(150mg/kg)和高劑量組(500mg/kg),每組10只。每天經(jīng)口灌胃1次,每周5天,連續(xù)4周。染毒期間每周觀察記錄小鼠體重變化,末次染毒24小時(shí)后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。2.采取小鼠的外周血進(jìn)行血常規(guī)分析;使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定血漿中免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6的含量;使用Mito SOX熒光染料結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS含量,使用ATP測定試劑盒和BCA蛋白測定試劑盒測定小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞ATP的含量;使用硫代巴比妥酸法測定丙二醛的含量、二硫代二硝基苯甲酸法測定谷胱甘肽過氧化物酶的活力、羥胺法測定總超氧化物歧化酶的活力。3.無菌解剖小鼠,摘取脾臟并計(jì)算脾臟系數(shù),并對小鼠脾臟進(jìn)行病理學(xué)檢查;使用TUNEL檢測試劑盒檢測脾臟細(xì)胞的凋亡情況;使用Cell Counting Kit-8試劑盒測定小鼠脾臟中T、B淋巴細(xì)胞增殖能力。4.應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)分析比較高劑量組和對照組中小鼠的脾臟蛋白質(zhì)表達(dá)差異,利用Gene Ontology和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,找出關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白并應(yīng)用Wes全自動(dòng)蛋白定量分析系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證差異蛋白及其相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:1.實(shí)驗(yàn)期間,沒有出現(xiàn)染毒直接導(dǎo)致老鼠死亡的情況發(fā)生,但染毒抑制了低、中和高劑量組小鼠的體重增長,高、中和低劑量組小鼠的體重分別從染毒后的第1、2和3周開始顯著低于對照組。染毒結(jié)束后,低、中和高劑量組小鼠外周血血常規(guī)計(jì)數(shù)均受到明顯影響,低、中和高劑量組小鼠的外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞和血紅蛋白計(jì)數(shù)顯著低于對照組,中、高劑量組小鼠的外周血血小板計(jì)數(shù)顯著低于對照組。2.低、中和高劑量組小鼠的外周血血漿中免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6含量較對照組顯著降低。低、中和高劑量組小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞的線粒體ROS較對照組顯著升高,高劑量組小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞的ATP含量較對照組顯著降低。中、高劑量組小鼠的外周血血漿丙二醛含量較對照組顯著升高,總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶含量較對照組顯著降低。3.低、中和高劑量組小鼠的脾臟重量較對照組顯著降低,中、高劑量組小鼠的脾臟系數(shù)較對照組顯著降低。染毒使小鼠的脾臟組織出現(xiàn)明顯的病理變化,造成組織細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、染色質(zhì)等損傷,中、高劑量組小鼠受損較為明顯。染毒使小鼠的脾臟組織中出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡。中、高劑量組小鼠的脾臟B細(xì)胞經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)的增殖能力較對照組顯著下降,增殖抑制百分率分別達(dá)到了18.38±4.56、36.08±3.04;中、高劑量組小鼠的脾臟T細(xì)胞經(jīng)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的增殖能力較對照組顯著下降,增殖抑制百分率分別達(dá)到了16.13±2.30、29.88±3.06。4.高劑量組和對照組小鼠的脾臟之間共篩選出251個(gè)差異蛋白(變化倍數(shù)1.5),這些蛋白富集在83條顯著差異的GO Terms和5條顯著差異的KEGG pathways中。定量分析發(fā)現(xiàn),在mRNA水平上,CD22、NF-κB p65的表達(dá)量顯著降低,BCL10表達(dá)量幾乎不變;在蛋白水平上,BCL10表達(dá)量顯著降低。結(jié)論:本文成功構(gòu)建了苯短期重復(fù)染毒小鼠模型,染毒小鼠體重增長受到明顯抑制,外周血常規(guī)指標(biāo)明顯下降。苯染毒小鼠血漿免疫球蛋白G、白介素-2和白介素-6含量顯著降低,表明苯染毒小鼠機(jī)體免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力顯著下降;外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體ROS產(chǎn)生顯著增加,ATP含量顯著降低表明了苯染毒小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能出現(xiàn)顯著異常;血漿氧化/抗氧化水平的測定結(jié)果顯示苯染毒導(dǎo)致小鼠外周血出現(xiàn)了顯著的氧化應(yīng)激。以上結(jié)果提示苯染毒導(dǎo)致小鼠外周血氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)了外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能的下降,導(dǎo)致其功能受損。此外,苯染毒還造成小鼠脾臟組織病理學(xué)改變,組織細(xì)胞大量凋亡,淋巴細(xì)胞增殖能力受到抑制;BCR及NF-κB信號通路中的CD22、BCL10和NF-κB p65可能是苯誘導(dǎo)小鼠脾臟免疫功能受損的關(guān)鍵調(diào)控分子。總之,苯染毒對小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞及脾臟免疫功能造成影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探究苯的免疫毒性效應(yīng)及其作用機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

相對分子質(zhì)量為 78，結(jié)構(gòu)式和結(jié)構(gòu)簡式如圖1 所示。常溫下是一種透明，無色的液體，在空氣中易揮發(fā)，微溶于水，易溶于丙酮、氯仿、乙醇和四氯化碳等有機(jī)溶劑。圖 1 苯的結(jié)構(gòu)式和結(jié)構(gòu)簡式苯是一種有毒的環(huán)境空氣污染物，主要來源于人類活動(dòng)，特別是煤、木材和石油等燃燒過程中有大量苯產(chǎn)生[1]。另外，汽油、汽車尾氣、工業(yè)廢氣和香煙煙霧中含有大量的苯[1]。過去，苯通常被用作油墨的成分、有機(jī)材料的溶劑、制備化學(xué)和藥物用品的原料以及無鉛汽油的添加劑等；現(xiàn)在，苯主要用于制造苯乙烯、苯酚、異丙苯、環(huán)己烷、苯胺、馬來酸酐、烷基苯和氯苯等有機(jī)化學(xué)品，，同時(shí)它是生產(chǎn)蒽醌、對苯二酚、烷基苯、六氯化苯、苯磺酸和其他用于生產(chǎn)藥物、染料、殺蟲劑和塑料產(chǎn)品的中間體[1, 2]。由于苯廣泛用于制造工農(nóng)業(yè)和日常生活用品，導(dǎo)致其接觸人數(shù)位于常見接觸化學(xué)毒品首位，對人類生產(chǎn)生活的安全性構(gòu)成極大的威脅[2]。人群接觸苯的途徑主要分為兩大類：職業(yè)暴露和非職業(yè)暴露。對于非職業(yè)暴露，接觸苯的主要來源是呼吸含有煙草煙霧、受過苯污染的空氣（例如，交通繁忙的地區(qū)、汽油加油站周圍、新裝修的房屋內(nèi)等），飲用受過苯污染的水或食用受過苯污染的食物等[3]。近些年，隨著人們生活水平的不斷提高，大多數(shù)家庭都會(huì)精心甚至過度裝修房屋，由此引發(fā)的以苯等揮發(fā)性有機(jī)物超標(biāo)造成的室內(nèi)環(huán)境污染問題受到了廣泛關(guān)注，更有學(xué)者認(rèn)為，諸如這類“室內(nèi)環(huán)境污染”是繼“煤煙污染”和“光化學(xué)污染”之后，人類正在面臨的第三次全球性的空氣污染問題[4]。在我國

軍事科學(xué)院碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于 SPF 級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，控制飼養(yǎng)環(huán)境為溫度 23±2℃70%、光照強(qiáng)度 200Lux 并且按照 12h/12h 進(jìn)行晝夜交替，實(shí)驗(yàn)食飲水，每隔 2 天更換新鮮的飼料、飲用水和墊料。在苯染毒鼠先置于 SPF 級動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，隨后按照隨機(jī)性的 個(gè)組：對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。每組均為 10分為兩籠飼養(yǎng)，每籠5只。低、中和高劑量組的染毒劑量分別為g 和 500mg/kg，以玉米油為溶劑配制苯溶液，采用灌胃的方式進(jìn)給予玉米油，灌胃容量按照 5ml/kg 計(jì)算。如圖 1.1，每天上午周 5 天，連續(xù) 4 周，每周一及處理小鼠之前稱取小鼠體重并記夜禁食，第 2 天上午 8:30 處死小鼠，提取生物樣品用于后續(xù)
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R99

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3 徐U

本文編號：2676961