【摘要】：隨著我國老齡化人口的增加,骨質(zhì)疏松患者數(shù)目也在逐年增加。目前,多數(shù)己上市的抗骨質(zhì)疏松藥物在發(fā)揮療效的同時仍存在不少副作用,尋找更加安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物的需求尤為迫切。骨質(zhì)疏松癥是一種骨重建異常導(dǎo)致的代謝性骨病,其中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的失衡是引起骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)改變的主要原因。因此,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和/或抑制破骨細(xì)胞分化是治療骨質(zhì)疏松癥的基本策略。RUNX2是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,也是多條參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨形成的信號通路的匯聚點。RUNX2轉(zhuǎn)錄激活劑可能具有潛在的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成的效應(yīng)。NF-κB則是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,抑制該因子的活性可抑制破骨細(xì)胞形成。因此,本課題擬分別利用反映RUNX2轉(zhuǎn)錄活性和反映NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞篩選模型,對小分子化合物庫和天然產(chǎn)物庫進(jìn)行篩選,以期發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)成骨分化和/或抑制破骨分化的候選陽性化合物,并對其進(jìn)行體內(nèi)外抗骨質(zhì)疏松活性評價和作用機制研究。為了實現(xiàn)這一目標(biāo),本研究分為兩個部分:一、基于RUNX2轉(zhuǎn)錄活性的高通量篩選與化合物T63的抗骨質(zhì)疏松作用機制研究研究目的:利用基于RUNX2轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞篩選模型,完成對小分子化合物庫的高通量篩選,并對活性最優(yōu)的目標(biāo)化合物T63進(jìn)行體內(nèi)外抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)評價和作用機制研究。研究方法:利用熒光素報告基因系統(tǒng),檢測待測化合物對RUNX2轉(zhuǎn)錄活性的影響。以多能間充質(zhì)干細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞C3H10T1/2和小鼠前體成骨細(xì)胞MC3T3-E1誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞作為主要研究對象,采用MTT法、p-NPP法、茜素紅染色和PCR等方法,分別研究候選化合物T63對成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(ALPL)活性、礦化結(jié)節(jié)形成和成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響,結(jié)合Western blot、ChIP和RNAi等技術(shù)考察T63對成骨細(xì)胞分化相關(guān)信號通路的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)和雙熒光素報告基因系統(tǒng)分析T63對成骨前體細(xì)胞中ROS水平以及雌激素應(yīng)答元件ERE活性的影響。油紅染色和實時定量PCR法檢測T63對間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪分化的影響。采用TRAP染色、F-actin染色、PCR和Western blot等方法,分別考察在成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系以及RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞模型中,T63對破骨細(xì)胞的形成、細(xì)胞骨架融合以及破骨分化相關(guān)基因表達(dá)和信號通路的影響。體內(nèi)采用卵巢去勢聯(lián)合地塞米松建立的骨質(zhì)疏松大鼠模型,考察T63對大鼠骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、血清生物標(biāo)記物等的影響。實驗結(jié)果:本研究通過對小分子化合物庫中20760個化合物進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)候選化合物T63可顯著上調(diào)小鼠成骨細(xì)胞模型中RUNX2的轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步研究表明,T63在不影響細(xì)胞增殖的情況下,能顯著上調(diào)小鼠成骨細(xì)胞ALPL的活性、礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目以及成骨分化相關(guān)基因Alpl、Bglap、Spp1、Runx2和Bmp2mRNA的表達(dá)。T63誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞分化的作用在人成骨細(xì)胞MG63和hFOB1.19中也得到了驗證。此外,該化合物也能抑制C3H10T1/2細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中脂滴的形成和相關(guān)基因Pparγ2,Srebf1和Fabp4的表達(dá)。T63能上調(diào)RUNX2基因和蛋白的表達(dá),增加RUNX2在Alpl基因啟動子區(qū)的聚集,而對轉(zhuǎn)錄因子OSX表達(dá)的影響不大。Runx2shRNA能減弱T63誘導(dǎo)的RUNX2活性和成骨細(xì)胞分化表型,提示T63的促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)有賴于RUNX2的表達(dá)。在機制上,T63不僅能上調(diào)Bmp2、Bmp4和Bmp7的mRNA的表達(dá)、誘導(dǎo)Smad1/5/8磷酸化,還能上調(diào)TCF轉(zhuǎn)錄活性、誘導(dǎo)GSK-3β磷酸化及增加β-catenin的核轉(zhuǎn)移;而BMPs通路抑制劑Noggin和WNT/β-catenin通路抑制劑DKK-1均可以減弱T63誘導(dǎo)的RUNX2的轉(zhuǎn)錄激活和成骨細(xì)胞分化表型,提示兩條信號通路通過影響RUNX2的活性參與調(diào)控了 T63的促成骨細(xì)胞分化效應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)T63能降低成骨前體細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,增強雌激素應(yīng)答元件ERE的轉(zhuǎn)錄活性。在對破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)方面,T63不僅抑制共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成,也能直接抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成和破骨分化相關(guān)基因的表達(dá),并可抑制Rankl基因表達(dá)以及MAPKs和Akt信號通路的活化。體內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示,與骨質(zhì)疏松大鼠模型組相比,5mg/kg和20mg/kgT63(灌胃給藥)可以顯著增加模型組的股骨、脛骨和椎骨骨密度,改善骨小梁結(jié)構(gòu);同時增加模型組血清ALPL水平和股骨橫切面成骨細(xì)胞的數(shù)目,抑制其血清NTX-1水平和股骨橫切面破骨細(xì)胞的形成。結(jié)論:經(jīng)高通量篩選獲得的化合物T63具有良好的體內(nèi)外抗骨質(zhì)疏松活性。T63可通過激活BMPs和經(jīng)典WNT/β-catenin雙重信號通路誘導(dǎo)RUNX2轉(zhuǎn)錄激活,進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成。T63還可通過下調(diào)MAPKs和Akt信號通路的活化而抑制破骨細(xì)胞分化和功能。該化合物有望發(fā)展成為潛在的抗骨質(zhì)疏松候選藥物。二、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑的篩選及秦皮甲素抑制破骨細(xì)胞分化效應(yīng)的研究研究目的:以NF-κB為潛在分子靶標(biāo),完成對天然化合物庫的初步篩選。對篩選得到的活性化合物秦皮甲素(AES)進(jìn)行體內(nèi)外抗骨質(zhì)疏松活性的評價和機制的研究。研究方法:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有熒光素報告基因的NF-κB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞建立反映NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞篩選模型。利用熒光素報告基因系統(tǒng)檢測在細(xì)胞篩選模型中天然化合物對熒光素酶活性的影響。MTT法檢測篩選得到的陽性化合物AES對RAW264.7細(xì)胞毒性作用。TRAP染色、F-actin染色和PCR等方法研究AES對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成、融合以及破骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)合Western blot、雙熒光素報告基因系統(tǒng)和基因過表達(dá)等技術(shù),研究AES抑制破骨細(xì)胞分化的分子機制。利用p-NPP法及茜素紅染色等方法,考察AES對MC3T3-E1細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的影響。同上方法采用卵巢去勢聯(lián)合地塞米松建立骨質(zhì)疏松模型大鼠,研究AES的體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松活性。實驗結(jié)果:本研究構(gòu)建了 NF-κB抑制劑篩選模型,從132個天然化合物中篩選發(fā)現(xiàn)AES可有效抑制NF-κB活性。5-20μM kMAES在不產(chǎn)生毒性的同時,能劑量依賴地抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成和F-actin環(huán)的形成,同時抑制Trap、Atp6v0d2、Cathepsin K、Mmp-9和Nfatc1等破骨分化相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),AES不僅能抑制RANKL下游的NF-κB通路,也能抑制MAPKs通路的激活。此外,AES能抑制Rank基因的表達(dá);過表達(dá)RANK可以減弱AES對破骨細(xì)胞形成和NF-κB活性的抑制作用。AES對成骨細(xì)胞分化的影響作用不明顯。動物實驗結(jié)果顯示,與骨質(zhì)疏松大鼠模型組相比,20 mg/kg和100 mg/kg AES可有效升高骨密度及骨體積分?jǐn)?shù),并降低血清中NTX-1水平。結(jié)論:本研究基于NF-κB轉(zhuǎn)錄活性建立細(xì)胞篩選模型,并從132個天然化合物中篩選得到活性化合物AES。AES能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,抑制骨質(zhì)疏松模型大鼠骨量的丟失。AES對破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用可能與AES抑制Rank基因表達(dá)、進(jìn)而影響RANKL下游NF-κB等信號通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R914;R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2676648