【摘要】：隨著生活水平提高,糖尿病的發(fā)病率也越來越高,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。而生物活性肽作為一種新型降血糖藥物,副作用較小,在防治糖尿病方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。傳統(tǒng)酶解法制備生物活性肽對(duì)自由蛋白酶的需求量較大,且酶活不穩(wěn)定。目前糙米已成為糖尿病患者的最佳食材,其營(yíng)養(yǎng)成分豐富,有助于胰臟分泌胰島素,降低血糖。因此本研究以糙米作為原料,使用固定化酶制備降血糖肽,檢測(cè)其降血糖活性。以聚偏氟乙烯微孔濾膜(F膜)作為載體,采用共價(jià)結(jié)合法固定胰蛋白酶,通過響應(yīng)面試驗(yàn)獲得固定化工藝參數(shù),采用掃描電鏡和紅外光譜對(duì)固定化酶進(jìn)行表征。建立固定化酶制備糙米降血糖肽的水解度動(dòng)力學(xué)模型。構(gòu)建糙米降血糖肽的分離純化方法,先后使用超濾、離子交換、凝膠過濾層析與反相高效液相方法,再采用液質(zhì)聯(lián)用方法分析降血糖肽氨基酸序列,然后進(jìn)行分子對(duì)接,建立抑制動(dòng)力學(xué)模型,從分子層面研究降血糖肽作用機(jī)制與類型。通過體內(nèi)檢測(cè)降血糖肽對(duì)高血糖小鼠的降血糖作用、生長(zhǎng)狀況以及腸道菌群平衡的影響,研究腸道菌群與糖尿病之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果如下:胰蛋白酶固定化最優(yōu)工藝為:戊二醛濃度2.11wt%,酶濃度6.43mg/mL,溫度23.57℃。在最優(yōu)條件下預(yù)測(cè)酶活回收率達(dá)到63.1947%,經(jīng)過驗(yàn)證酶活回收率為62.25%。固定化胰蛋白酶的最適溫度為55℃,最適pH值為8.5,熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性均高于自由酶;同時(shí)固定化酶在重復(fù)使用6次以后,仍然保留初始酶活的67.82%;與自由酶相比,固定化胰蛋白酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高了18.00%。根據(jù)掃描電鏡圖可以看出固定化酶載體表面出現(xiàn)大量球狀突出點(diǎn),同時(shí)在傅里葉紅外光譜圖上胰蛋白酶內(nèi)肽鍵伸縮振動(dòng)的酰胺帶在1100~1000cm~(-1)出現(xiàn)特征峰。以水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)分析自由酶與固定化酶水解能力,固定化酶最優(yōu)水解條件為:加酶量520 cm~2/g,底物濃度6 mg/mL,溫度55℃,pH 8.5,反應(yīng)時(shí)間50min,水解度可以達(dá)到24.72%,相比自由酶水解度提高了63.38%。在固定化酶酶解體系最優(yōu)條件下,固定化酶重復(fù)使用5次后,水解度保留初始水解度的72.34%。建立固定化酶可控酶解動(dòng)力學(xué)模型為DH=4.5767ln[1+(5.2121 E_0/S_0-0.5032)t]。以α-葡萄糖苷酶抑制率作為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別檢測(cè)不同多肽組分的降血糖活性,其中P-II-B-b-2組分活性最大,IC50為0.097mg/mL。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜推斷降血糖肽的氨基酸組成序列,分子量為362.99的多肽可能是Gly-Met-Arg,分子量為476.11的多肽包括Asn-Trp-Arg、Gly-Asp-Lys-Arg和Asp-Gly-Lys-Arg,分子量為589.12的多肽包括Lys-Arg-Glu-Arg、Pro-Trp-Met-Arg、Val-Trp-Glu-Arg和Cys-Arg-Gly-Pro-Arg。通過分子對(duì)接,多肽可以與α-葡萄糖苷酶中心部位緊密結(jié)合,抑制α-葡萄糖苷酶的活性。其中Gly-Asp-Lys-Arg的IC50最小,為0.039mg/mL,抑制效果最好。最后通過研究Gly-Asp-Lys-Arg對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)發(fā)現(xiàn),K_m值基本保持不變,而V_m逐漸減少,屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用類型,抑制常數(shù)K_m=5.405×10~(-3)mol/L。多肽治療35天后,四氧嘧啶高血糖小鼠的血糖值明顯降低,小鼠糖尿病癥狀,如小鼠毛色、活動(dòng)能力、反應(yīng)能力與食欲等各種情況均有明顯改善,并提高存活率。通過對(duì)小鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌分離鑒定,腸道菌群包括鏈球菌、腸桿菌、微球菌、假單胞桿菌與弧菌等。高血糖小鼠腸道內(nèi)有害菌數(shù)量增加,益生菌數(shù)量減少。經(jīng)糙米多肽治療后,高血糖小鼠血糖降低,腸道微生態(tài)平衡得到明顯改善恢復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q814.2;R965

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