【摘要】：研究背景及目的化療是治療腫瘤的主要方法之一,而化療引起的多藥耐藥是成功化療的主要障礙。ATP結(jié)合盒膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以利用能量把抗腫瘤藥物排出細(xì)胞外從而產(chǎn)生多藥耐藥性。ABCG2是ABC家族常見轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一,ABCG2屬于半轉(zhuǎn)運(yùn)體由一個(gè)6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)位于N-末端的ATP結(jié)合盒組成。ABCG2在腫瘤細(xì)胞膜上過度表達(dá)時(shí)會(huì)結(jié)合底物抗癌藥物,同時(shí)ATP結(jié)合到ABCG2的ATPase結(jié)合位點(diǎn),水解ATP釋放能量使化療藥物被泵出胞外。降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度從而使腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性。因此抑制ABC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體功能是克服多藥耐藥的一個(gè)有效的方法。然而,至今還沒有安全有效的多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑被批準(zhǔn)用于臨床。近年來,一些酪氨酸激酶抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)ABC蛋白過表達(dá)引起的多藥耐藥。Dacomitinib是第二代EGFR酪氨酸激酶抑制劑,對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌有很好的療效,并已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床。由于有報(bào)道酪氨酸激酶抑制劑同時(shí)可以逆轉(zhuǎn)多種ABC蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥,本文主要研究dacomitinib逆轉(zhuǎn)ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)引起的多藥耐藥作用。研究方法細(xì)胞毒性測定用和體內(nèi)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)評(píng)估使用MTT法;以H460/MX20細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型探討dacomitinib體內(nèi)逆轉(zhuǎn)活性;蛋白測定用Western blotting;ABCG2的m RNA表達(dá)水平用RT-PCR法測定;Dox,Rho 123,hoechst33342積累、Rho123外排和ABCG2的膜蛋白表達(dá)用流式細(xì)胞儀測定;釩敏感法測定dacomitinib對(duì)ABCG2 ATPase活性;[125I]-IAAP光親和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)探討dacomitinib和ABCG2的作用位點(diǎn)情況。結(jié)果Dacomitinib能夠濃度依賴性地增加ABCG2底物拓?fù)涮婵岛蚆X對(duì)ABCG高表達(dá)細(xì)胞S1-M1-80和H460/MX20的細(xì)胞毒性,1μM dacomitinib顯著逆轉(zhuǎn)S1-M1-80和H460/MX20細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵岛蚆X的耐藥性,但dacomitinib不改變親本細(xì)胞S1和H460細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵岛蚆X的藥物敏感性。Dacomitinib對(duì)ABCB1介導(dǎo)的MDR無明顯逆轉(zhuǎn)作用。在1μM dacomitinib與Dox聯(lián)用時(shí),對(duì)KBv200細(xì)胞產(chǎn)生微弱的協(xié)同細(xì)胞毒作用。Dacomtinib在較低濃度下能明顯激活A(yù)BCG2 ATPase活性,并能與[125I]-IAAP競爭性的與ABCG2結(jié)合,表明dacomitinib可能是ABCG2底物。dacomitinib(5 mg/kg,p.o)顯著增加拓?fù)涮婵档男Ч?在以H460/MX20細(xì)胞建立的MDR裸鼠移植瘤模型中dacomitinib顯著提高拓?fù)涮婵档目鼓[瘤活性,而dacomitinib或拓?fù)涮婵祮为?dú)給藥組則無明顯抑瘤作用。所有實(shí)驗(yàn)組的老鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。Dacomitinib濃度依賴性地增加Dox和Rho123在S1-M1-80細(xì)胞中的積累,但對(duì)Dox和Rho 123在親本細(xì)胞S1中的積累無明顯影響;Dacomitinib濃度依賴性地增加hoechst 33342在H460/MX20細(xì)胞中的積累,但對(duì)hoechst 33342在親本細(xì)胞H460中的積累無明顯影響。Dacomitinib顯著抑制S1-M1-80細(xì)胞對(duì)Rho123的外排作用;Dacomitinib對(duì)ABCG2的蛋白和m RNA表達(dá)水平?jīng)]有影響。表明dacomitinib通過抑制ABCG2介導(dǎo)的藥物外排功能恢復(fù)ABCG2高表達(dá)MDR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在S1-M1-80、S1、H460和H460/MX20細(xì)胞中dacomitinib對(duì)AKT和ERK的磷酸化水平?jīng)]有顯著的阻斷作用,表明dacomitinib恢復(fù)ABCG2高表達(dá)的MDR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性不依賴于dacomitinib對(duì)酪氨酸激酶受體下游信號(hào)通路磷酸化的阻斷作用。結(jié)論:1.Dacomitinib在體外和體內(nèi)逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的MDR,對(duì)ABCB1介導(dǎo)的MDR則無明顯逆轉(zhuǎn)作用。2.Dacomitinib通過與ABCG2直接作用抑制ABCG2藥物外排泵功能發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用,是有開發(fā)前景的第三代逆轉(zhuǎn)劑。3.Dacomitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能在體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的多藥耐藥,這種逆轉(zhuǎn)作用不依賴于dacomitinib對(duì)ERK和AKT的磷酸化的阻斷作用。4.Dacomitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的耐藥,對(duì)指導(dǎo)dacomitinib臨床聯(lián)合ABCG2底物化療具有一定意義。
【圖文】：

若有明顯發(fā)光則 1 min 即可）。打^u膠片夾，拿出膠片放入膠片顯影儀中沖洗。2. 統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少 3 次，數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。本研究用 SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異用 Student’s t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng) P<0.05 時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3. 結(jié)果3.1 Dacomitinib 的細(xì)胞毒性試驗(yàn)我們首先測定dacomitinib在本研究所用細(xì)胞株KB、KBV200(圖1 a)、H460、H460/MX20( 圖 1b) 、 S1 、 S1-MI-80( 圖 1c) 、 HEK293/pcDNA3.1 、HEK293/ABCG2-482-T7 和 HEK293/ABCG2-482-R2 (圖 1 d、e)的細(xì)胞毒，如圖1 所示 dacomitinib 在 1 μM 時(shí)，本研究所用細(xì)胞存活率均 >80%。然后我們選用1，0. 5 和 0.25 μM 3 個(gè)濃度梯來用于接下來的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。

Dacomitinib 增加拓?fù)涮婵档目拱┬Ч?H460/MX20 小鼠移植瘤模型中。(a)腫瘤生長體積趨勢圖(n =7) (b)25 天后小鼠取下的腫瘤圖像(c)在給藥過程中每組小鼠平均體重的改變(d)每組小鼠的平均瘤重。* p< 0.05, ** p< 0.013.6 Dacomitinib 增加 Dox、Rho123 和 hoechst 33342 在 ABCG2 過表達(dá)細(xì)胞中積累以上數(shù)據(jù)表明了 dacomitinib 在體內(nèi)和體外都可以顯著地增加過表達(dá)ABCG2 的腫瘤耐藥細(xì)胞的對(duì)傳統(tǒng)底物化療敏感性。如圖 3 所示，耐藥細(xì)胞S1-MI-80 內(nèi) Dox 和 Rho 123 的積累水平明顯低于親代 S1 細(xì)胞。分別用 0. 25，0.5 和 1 μM 的 dacomitinib 處理細(xì)胞后，，Dox 和 Rho 123 在 S1-MI-80 細(xì)胞中的累積明顯增高。與陽性對(duì)照 FTC 組中 Dox 和 Rho 123 的累積水平相近。而dacomitinib 沒有改變 S1 細(xì)胞株中 Dox 和 Rho 123 的累積水平。染料 hoechst
【學(xué)位授予單位】：湖北科技學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R96

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本文編號(hào)：2671692