【摘要】：研究背景及目的化療是治療腫瘤的主要方法之一,而化療引起的多藥耐藥是成功化療的主要障礙。ATP結合盒膜通道轉運蛋白可以利用能量把抗腫瘤藥物排出細胞外從而產(chǎn)生多藥耐藥性。ABCG2是ABC家族常見轉運蛋白之一,ABCG2屬于半轉運體由一個6個跨膜結構域和一個位于N-末端的ATP結合盒組成。ABCG2在腫瘤細胞膜上過度表達時會結合底物抗癌藥物,同時ATP結合到ABCG2的ATPase結合位點,水解ATP釋放能量使化療藥物被泵出胞外。降低細胞內藥物的濃度從而使腫瘤細胞獲得耐藥性。因此抑制ABC蛋白轉運體功能是克服多藥耐藥的一個有效的方法。然而,至今還沒有安全有效的多藥耐藥的逆轉劑被批準用于臨床。近年來,一些酪氨酸激酶抑制劑相繼被發(fā)現(xiàn)可以逆轉ABC蛋白過表達引起的多藥耐藥。Dacomitinib是第二代EGFR酪氨酸激酶抑制劑,對EGFR突變的非小細胞肺癌有很好的療效,并已經(jīng)被批準用于臨床。由于有報道酪氨酸激酶抑制劑同時可以逆轉多種ABC蛋白介導的多藥耐藥,本文主要研究dacomitinib逆轉ABCG2轉運蛋白過表達引起的多藥耐藥作用。研究方法細胞毒性測定用和體內逆轉倍數(shù)評估使用MTT法;以H460/MX20細胞建立裸鼠移植瘤模型探討dacomitinib體內逆轉活性;蛋白測定用Western blotting;ABCG2的m RNA表達水平用RT-PCR法測定;Dox,Rho 123,hoechst33342積累、Rho123外排和ABCG2的膜蛋白表達用流式細胞儀測定;釩敏感法測定dacomitinib對ABCG2 ATPase活性;[125I]-IAAP光親和標記實驗探討dacomitinib和ABCG2的作用位點情況。結果Dacomitinib能夠濃度依賴性地增加ABCG2底物拓撲替康和MX對ABCG高表達細胞S1-M1-80和H460/MX20的細胞毒性,1μM dacomitinib顯著逆轉S1-M1-80和H460/MX20細胞對拓撲替康和MX的耐藥性,但dacomitinib不改變親本細胞S1和H460細胞對拓撲替康和MX的藥物敏感性。Dacomitinib對ABCB1介導的MDR無明顯逆轉作用。在1μM dacomitinib與Dox聯(lián)用時,對KBv200細胞產(chǎn)生微弱的協(xié)同細胞毒作用。Dacomtinib在較低濃度下能明顯激活ABCG2 ATPase活性,并能與[125I]-IAAP競爭性的與ABCG2結合,表明dacomitinib可能是ABCG2底物。dacomitinib(5 mg/kg,p.o)顯著增加拓撲替康的效果;在以H460/MX20細胞建立的MDR裸鼠移植瘤模型中dacomitinib顯著提高拓撲替康的抗腫瘤活性,而dacomitinib或拓撲替康單獨給藥組則無明顯抑瘤作用。所有實驗組的老鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。Dacomitinib濃度依賴性地增加Dox和Rho123在S1-M1-80細胞中的積累,但對Dox和Rho 123在親本細胞S1中的積累無明顯影響;Dacomitinib濃度依賴性地增加hoechst 33342在H460/MX20細胞中的積累,但對hoechst 33342在親本細胞H460中的積累無明顯影響。Dacomitinib顯著抑制S1-M1-80細胞對Rho123的外排作用;Dacomitinib對ABCG2的蛋白和m RNA表達水平?jīng)]有影響。表明dacomitinib通過抑制ABCG2介導的藥物外排功能恢復ABCG2高表達MDR細胞對化療藥物的敏感性。在S1-M1-80、S1、H460和H460/MX20細胞中dacomitinib對AKT和ERK的磷酸化水平?jīng)]有顯著的阻斷作用,表明dacomitinib恢復ABCG2高表達的MDR細胞對化療藥物的敏感性不依賴于dacomitinib對酪氨酸激酶受體下游信號通路磷酸化的阻斷作用。結論:1.Dacomitinib在體外和體內逆轉ABCG2介導的MDR,對ABCB1介導的MDR則無明顯逆轉作用。2.Dacomitinib通過與ABCG2直接作用抑制ABCG2藥物外排泵功能發(fā)揮逆轉作用,是有開發(fā)前景的第三代逆轉劑。3.Dacomitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能在體內和體外逆轉ABCG2介導的多藥耐藥,這種逆轉作用不依賴于dacomitinib對ERK和AKT的磷酸化的阻斷作用。4.Dacomitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能逆轉ABCG2介導的耐藥,對指導dacomitinib臨床聯(lián)合ABCG2底物化療具有一定意義。
【圖文】：

若有明顯發(fā)光則 1 min 即可）。打^u膠片夾，拿出膠片放入膠片顯影儀中沖洗。2. 統(tǒng)計分析所有實驗均重復至少 3 次，數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。本研究用 SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學差異用 Student’s t 檢驗進行分析，當 P<0.05 時有統(tǒng)計學差異。3. 結果3.1 Dacomitinib 的細胞毒性試驗我們首先測定dacomitinib在本研究所用細胞株KB、KBV200(圖1 a)、H460、H460/MX20( 圖 1b) 、 S1 、 S1-MI-80( 圖 1c) 、 HEK293/pcDNA3.1 、HEK293/ABCG2-482-T7 和 HEK293/ABCG2-482-R2 (圖 1 d、e)的細胞毒，如圖1 所示 dacomitinib 在 1 μM 時，本研究所用細胞存活率均 >80%。然后我們選用1，0. 5 和 0.25 μM 3 個濃度梯來用于接下來的逆轉實驗。

Dacomitinib 增加拓撲替康的抗癌效果在 H460/MX20 小鼠移植瘤模型中。(a)腫瘤生長體積趨勢圖(n =7) (b)25 天后小鼠取下的腫瘤圖像(c)在給藥過程中每組小鼠平均體重的改變(d)每組小鼠的平均瘤重。* p< 0.05, ** p< 0.013.6 Dacomitinib 增加 Dox、Rho123 和 hoechst 33342 在 ABCG2 過表達細胞中積累以上數(shù)據(jù)表明了 dacomitinib 在體內和體外都可以顯著地增加過表達ABCG2 的腫瘤耐藥細胞的對傳統(tǒng)底物化療敏感性。如圖 3 所示，耐藥細胞S1-MI-80 內 Dox 和 Rho 123 的積累水平明顯低于親代 S1 細胞。分別用 0. 25，0.5 和 1 μM 的 dacomitinib 處理細胞后，，Dox 和 Rho 123 在 S1-MI-80 細胞中的累積明顯增高。與陽性對照 FTC 組中 Dox 和 Rho 123 的累積水平相近。而dacomitinib 沒有改變 S1 細胞株中 Dox 和 Rho 123 的累積水平。染料 hoechst
【學位授予單位】：湖北科技學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R96

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本文編號：2671692